[发明专利]人表皮干细胞的分离与培养方法

权利要求书

1.人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、消毒：将包皮环切术取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡1～2min，PBS漂洗至肉眼观察不再有碘伏着色；

b、分离表皮与真皮：修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约为0.5cm×1cm大小的皮片；加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS清洗后用眼科镊子分离表皮与真皮，得到表皮组织；

c、收集：剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化5～10min，终止消化，过滤，离心，PBS洗涤，收集细胞；

d、培养：用K-SFM培养液将收集的细胞制成2.5×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种单细胞悬液于包被了IV型胶原的培养器皿中，37℃静置10min；弃未贴壁细胞，用PBS漂洗，加入K-SFM培养液；37℃、5%CO₂培养；次日更换细胞培养液，继续培养，每2天换液1次；

e、传代：待细胞生长密度为70～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，终止消化，离心，收集细胞，按细胞接种面积扩大4～6倍传代；

上述所有操作均在无菌条件下进行。

2.如权利要求1所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤b中所述的0.25%的中性蛋白酶Ⅱ的配置方法为，0.5g中性蛋白酶Ⅱ溶入100mL0.1MPBS中，搅拌溶解，过滤，-20℃保存。

3.如权利要求1或2所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤c中所述的消化是指：步骤d中所述的K-SFM培养液包含下述成分：重组人表皮生长因子rEGF0.1～0.2ng/mL，牛垂体提取物BPE20～30μg/mL；CaCl₂0.05mM；青霉素、链酶素均为100U/mL。

4.如权利要求1～3任一项所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤d中所述的包被了IV型胶原的培养器皿采用如下方法制备：按照10μg/cm²计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养器皿中，是液体充分覆盖培养器皿的培养面，4℃放置约12～24小时，使用前采用PBS清洗。

5.如权利要求1～4任一项所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤e中进行消化前去掉原培养液，并用PBS清洗细胞。

6.如权利要求1～5任一项所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：步骤e中消化是指在37℃、5%CO₂下培养6～10分钟。

7.如权利要求1～6任一项所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：所述的终止消化采用含10%小牛血清的RPMI1640培养基。

8.如权利要求1所述的人表皮干细胞的分离与培养方法，其特征在于：所述的离心为1000rpm/min条件下离心5min。