[发明专利]一株高产乳酸菌及其发酵蛋壳制备乳酸钙的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株高产乳酸的乳酸菌及其发酵蛋壳制备乳酸钙的方法。

背景技术

肠球菌（Enterococcus）是自然界及人和动物体内广泛分布的革兰氏阳性球菌，蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）是一种多被报道为产细菌素的肠球菌，能杀灭或抑制一些病原菌的生长，其中Enterococcus mundtii ST4SA已被列为国内保藏的益生菌菌种，蒙氏肠球菌产抗菌素和抗病毒肽的报道非常常见，有报道用蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii ST4SA和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum423以婴儿奶粉配方为基质作为益生菌。肠球菌具有产乳酸的能力，但目前尚无利用肠球菌发酵制备乳酸的报道。

近年来，蛋壳的综合利用研究在不断深入。将蛋壳的钙转化成易吸收的有机钙是蛋壳综合利用的一个重要方面。其中乳酸钙因其具有钙含量高、溶解度较大、吸收率高、安全性高、价格合理等优点而备受关注。在目前的研究中，蛋壳制备乳酸钙主要采用化学方法，研究较多的为煅烧法，煅烧法耗能大，成本高，煅烧产生大量的二氧化碳和粉尘，对环境造成了污染。水热法和直接中和法避免了高温煅烧蛋壳所造成的环境污染，但这两种方法需大量购买乳酸，成本较高。微生物法制备乳酸钙是一个可以减少污染且增加经济效益降低成本的有效途径，目前还没有用微生物发酵的方法将蛋壳直接制备成乳酸钙的文献报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株高产乳酸菌。

本发明所提供的高产乳酸菌为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii），命名为HNMD-25，于2014年1月9日送交位于中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.8699。

本发明所提供的高产乳酸菌分离自长期深埋的废弃蛋壳土样中。

本发明所提供的高产乳酸菌获得方法为：

（1）采样。样品采自蛋品加工场地长期深埋蛋壳的土壤中。

（2）分离初筛。采用MRS培养基为底物，并进行厌氧培养，在MRS培养基上反复划线分离纯化，观察菌落形态，选取针尖大小的乳白色透明、湿润且具有光泽的菌落，进一步用显微镜镜检观察菌体形态，筛选出革兰氏阳性小球菌X株继续进行划线分离，分别获得纯培养。

（3）复筛。在MC培养基上点样，挑选产乳酸并形成溶钙圈的菌株。

（4）诱变及高产乳酸菌株的获得。通过紫外（UV）和亚硝基胍（NTG）诱变并以MC培养基中的溶钙圈为标准，得到乳酸高产菌株：将培养18-24h后的菌液离心收集菌体并用无菌水洗涤几次后加无菌水制成菌悬液，以0.3mg/mL加入NTG，于摇床上振荡处理40min，多次离心洗涤菌体，并制成菌悬液，取0.1mL菌液涂布于MRS固体平板并厌氧培养18-24h后，将平板置于20W紫外灯下诱变，照射距离为30cm，1.5min，继续厌氧培养18-24h后取菌体在MC平板上点样，选取溶钙圈大于对照的菌落，进行传代，获得稳定的纯培养菌株，将其命名为Enterococcus mundtii HNMD-25。

（5）鉴定。生理生化性质鉴定。糖发酵试验显示，菌株可以利用蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、棉籽糖、水杨苷、七叶苷、山梨醇发酵产酸，不能利用纤维二糖，能部分利用松三糖和蜜二糖；石蕊牛奶试验、乙酰甲基甲醇V-P试验、甲基红（M.R.）试验、柠檬酸盐试验显示为阳性，过氧化氢酶试验，淀粉水解试验，酪素水解试验，明胶液化试验，厌氧硝酸盐产气试验，硫化氢产生试验，吲哚试验等各生化性质均显示阴性；耐温度、酸碱、盐性试验显示在43℃下仍能生长，在低盐和偏酸性环境下均能生长，但在10%的较高盐浓度和pH4.3的较酸性环境不再生长。

菌株16S rDNA序列鉴定。采用CTAB法提取菌体总DNA并进行16S PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳纯化后切胶测序，将序列与GenBank中核酸数据（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行blast比对，与一株蒙氏肠球菌ATCC43186的同源性达到99%，结合生理生化性质结果与伯杰细菌鉴定手册、常见细菌系统鉴定手册与乳酸细菌分离鉴定及实验方法等判断，最终确认分离获得的菌株为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。

（6）产乳酸能力。采用摇床液体培养发酵，发酵液中的乳酸含量可达60.375-72.064g/L，葡萄糖转化率（被发酵的葡萄糖占葡萄糖总量的比例）为66.4-79.3%。