[发明专利]一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

背景技术

很多研究发现植物真菌病害生物防治菌深绿木霉（Trichoderma atroviride）能激发植物本身的防御系统而使植物能够抵御病原菌的侵害，即诱导植物产生抗病性，从而促进植物的生长。木霉菌诱导植物抗病性机制是对植物免疫能力的整体提升，而竞争、重寄生、抗生机制是植物病害生物防治菌与病原微生物单一的作用过程。系统获得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）是诱导抗性的两种形式。SAR指植物由坏死性病原物侵染或者局部组织经化学诱导物处理后，导致植物对后续多种病原物侵染产生的广谱、持久和系统的抗性，主要通过水杨酸（Salicylic acid，SA）信号传递途径激活；ISR指生物或非生物因子作用于宿主植物后，激活了该植物自身的物理或化学屏障，从而产生系统抗性的过程，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是ISR的一个重要信号传递途径。许多研究发现，深绿木霉ACCC30153中分泌的刺激植物响应蛋白Epl1（Eliciting plant response protein1）是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于cerato-platanin家族，含有4个半胱氨酸残基组成2个二硫键，N端存在分泌信号肽，具有疏水性，无毒，该蛋白无任何酶活性，却具有较高的刺激植物响应的作用，能够诱导植物产生抗性，同时还能促进植物生长。但是，深绿木霉菌丝体发酵后产生的蛋白及代谢产物较多，很难直接分离Epl1蛋白，工作量大、成本较高。

发明内容

本发明的目的是要解决深绿木霉菌丝体发酵后产生的蛋白及代谢产物较多，很难直接分离Epl1蛋白，工作量大、成本较高的问题，提供了一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌及其构建方法。

本发明一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epl1为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧菌，菌落呈圆形、光滑、无色、透明。

本发明一株含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，是通过以下步骤进行的：

一、提取深绿木霉的菌丝体cDNA：在28℃，200转/分钟的条件下，将深绿木霉菌丝体在1/4PD培养基中培养48h，收集菌丝体，然后提取总RNA，并将总RNA反转录为cDNA；

二、原核表达载体pGEX-Epl1的构建：以步骤一得到的深绿木霉的菌丝体cDNA为模板，Ep1e和Ep2e为引物进行PCR扩增和纯化，得到PCR产物；再从大肠杆菌TOP10-pGEX-4T-2中提取质粒pGEX-4T-2，然后先用BamHI分别对质粒pGEX-4T-2和PCR产物进行单酶切，回收酶切产物，再用SacI分别对酶切产物进行单酶切，获得载体DNA质粒和DNA纯化片段，将载体DNA质粒和DNA纯化片段通过DNA连接酶进行连接，再通过大肠杆菌TOP10感受态细胞进行转化后得到重组载体pGEX-Epl1，其中DNA连接酶为T4DNA Ligase；

三、大肠杆菌转化：将步骤二得到的重组载体pGEX-Epl1转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，然后置于含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37℃的条件下倒置培养12h后得到含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌BL21-Epl1单菌落，即完成含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌的构建。

本发明的含有刺激植物响应蛋白Epl1基因的大肠杆菌工程菌在其发酵性能不受影响的情况下，重组蛋白rEpl1诱导后对山新杨（Populus dividiana×P.bolleana）的水杨酸、茉莉酸和生长素信号传递途径相关基因表达有明显激发作用，而且能引起山新杨生理酶活性的显著变化。因此，重组蛋白rEpl1不仅能诱发山新杨产生抗性，提升山新杨防御能力，还能有效促进山新杨生长。筛选得到的大肠杆菌工程菌BL21-Epl1能高效表达Epl1蛋白，且对发酵设备及条件没有特殊要求，生产工艺简单，成本低廉，因而有广泛的应用前景，能为林区带来显著经济效益。

附图说明

图1为试验1步骤一中Epl1基因PCR产物的电泳图；