[发明专利]测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种实时测定阳离子聚合物（Cationic Polymeric，CP）装载siRNA体系中siRNA释放的方法。

背景技术

小干扰RNA(siRNA)由21～23个碱基对构成，可在细胞质中特异性与其碱基对互补的信使RNA(mRNA)结合并使其经核酸酶降解，从而阻断其编码蛋白质的表达，即通过RNA干扰(RNAi)实现基因沉默。因此，siRNA作为药物在癌症和流感、炎等病毒感染疾病治疗领域有重要科学意义和应用价值。然而，荷负点的亲水性siRNA难以跨越表面负电的疏水性细胞膜，易被核酸酶降解及快速从血液循环中清除。因此需要安全高效的载体释放系统保护并高效运送进入细胞发挥功能。

理想的siRNA载体应具有高效、稳定，并且无毒、靶向性好等特点。siRNA载体主要分为病毒型和非病毒型两种。病毒型siRNA载体虽然转染效率高，但同时具有免疫原性、潜在的致瘤性，且装载容量有限、成本高等缺陷而限制其应用。因此，非病毒型载体的应用受到重视。

阳离子聚合物作为非病毒siRNA载体的一类，其转导效率虽低于病毒载体，但因其具有无免疫原性、低毒、装载容量大、制备容易等优势而引起广泛关注。阳离子聚合物所携带正电荷，可与带负电荷siRNA通过静电相互作用，自聚集形成纳米结构复合体系，无需使用有机溶剂及超声处理，减少对核酸损伤。

阳离子聚合物装载siRNA进入细胞，即要在siRNA进入细胞前保持复合状态的稳定而避免siRNA提前释放而遭核酸酶降解；同时还要求载体到达细胞质后及时释放siRNA而发挥基因沉默功能。无论siRNA递送过程中释放过早或过晚，都会降低最终基因沉默效果。因此，明确siRNA释放过程对提高阳离子聚合物载siRNA体系的基因沉默效果有重要意义。实际操作中siRNA浓度极低，一般低于50nM，同时游离siRNA与处于复合态的siRNA亦极难分离，最终导致常规方法无法检测siRNA释放过程。

移荧光共振能量转移（FRET）是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。产生FRET的条件（附图1）主要有三个：（1）供体与受体间在合适的距离（1～10nm）；（2）供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，这是能量匹配的条件；（3）供体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。

FRET的效率用E表示，E值可由以下几种方式测定：用荧光强度表征（E=1-I_DA/I_D，I_DA表示A存在时D的荧光强度）；用量子产率表征（E=1-φ_DA/φ_D）；用荧光寿命表征（E=1-τ_DA/τ_D）。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备，既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率，也可以用时间分辨仪测定其荧光寿命。随着成像技术的发展，用显微成像的方法可更直观地观测FRET地发生。

由于FRET现象的效率对荧光探针间距离变化十分敏感，即两种荧光物质间距变化即导致FRET效率变化。阳离子聚合物载siRNA FRET体系中，siRNA释放过程伴随FRET探针的分离及FRET效率的降低。因此体系FRET效率降低曲线即为siRNA释放曲线。

Christopher A.Alabi等人将分别标记了AlexaFluor594（荧光供体）与AlexaFluor647（荧光受体）的siRNA共同装载入PEI纳米复合物中（Christopher A.Alabi，Kevin T.Love，Gaurav Sahay，et al.FRET-Labeled siRNA Probes forTracking Assembly and Disassembly of siRNANanocomplexes[J].ACS Nano,6(2012):6133-6141）。当siRNA处于复合态时，两种荧光分子间发生FRET现象，而随着siRNA释放，这种FRET效率逐渐减弱。文中比较了三种载体装载siRNA在细胞内的释放过程：b-PEI组几乎不见siRNA释放，C14-113组siRNA于2小时内快速释放；而ND98组可在6小时内几乎保持相同的释放速率。