[发明专利]一种高通量快速提取植物总DNA的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及植物DNA提取技术领域，具体涉及一种高通量快速提取植物总DNA的方法及其试剂盒。

背景技术

随着生物技术和植物基因工程的快速发展，以转基因技术为手段的植物遗传改良已成为农业生物技术育种的重要途径。而植物基因组DNA的提取和纯化是基因工程研究的基础操作，实施分子标记、基因文库构建、转基因检测、分子标记育种都是要以提取DNA为前提的。

目前，植物DNA的常规提取方法主要有SDS/酚/氯仿提取法、CTAB法、尿素提取法等，但这些方法操作复杂、耗时长，提取效率低，难以适用于大量样品的检测，而且使用了大量挥发性有机溶剂，产生大量的有毒废液，同时危害操作人员健康。因此建立一种简便有效的DNA提取方法是十分必要的。

公开号为CN102643800B的中国专利文献公开了一种提取植物DNA的方法及其专用试剂盒，该试剂盒包括缓冲液A和缓冲液B，其中，缓冲液A是由以下成分组成的水溶液：乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）5mmol/L，NaCl0.25M，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）2g/100ml，Tris-HCl缓冲液（1M、pH8.0）10ml/100ml；缓冲液B是由以下成分组成的水溶液：Tris-HCl缓冲液（1M、pH8.0）10ml/100ml，乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）25mmol/L，NaCl1.4M，CTAB3g/100ml，偏亚硫酸氢钠1g/100ml，抗坏血酸钠1g/100ml，PVP2g/100ml，β-巯基乙醇100μl/100ml。提取植物DNA时，（1）将缓冲液A与植物组织粉末混匀，冰浴，离心，弃上清，收集沉淀；（2）将缓冲液B与步骤（1）所得沉淀混匀，放置，离心，收集上清液；所述放置的方法为60℃-70℃水浴90-120min；（3）用氯仿异戊醇溶液从步骤（2）中所得上清液中提取DNA，再进行去RNA及沉淀DNA的步骤，得到目的DNA。

该试剂盒和提取方法的不足之处在于，两种缓冲液的组成均较为复杂，仍含有挥发性有机溶剂，提取后产生大量的有毒废液，仍未消除传统方法中所存在的缺陷；提取方法也较为复杂繁琐，耗时较长。

文献（Zhanguo Xin,Jeff P.Velten,Melvin J.Oliver,and John J.Burke.High-Throughput DNA Extraction Method Suitable for PCR.BioTechniques,2003,34:820-826.）公开了一种用于高通量提取植物DNA的缓冲液A和缓冲液B，该缓冲液A是由以下成分组成的水溶液：0.1M NaOH，2%tween20，缓冲液B是由以下成分组成的水溶液：100mM Tris-HCl，2mM EDTA。这两种缓冲液的不足之处在于，提取的总DNA质量较差，以该总DNA进行PCR获得的扩增产物最大只有300bp，并且这两种缓冲液只能现配现用，若放置一段时间后再进行总DNA提取，DNA的提取率明显降低。

发明内容

本发明提供了一种高通量快速提取植物总DNA的试剂盒，该试剂盒中的两种缓冲液组成简单，保存时间长，提取到的总DNA质量较好。

一种高通量快速提取植物总DNA的试剂盒，包括缓冲液A和缓冲液B，所述缓冲液A为0.05～0.12M的NaOH水溶液，所述缓冲液B中含有90～100mM Tris-HCl（pH8.0）、1.8～2.5mM EDTA（pH8.0）。

本发明还提供了一种利用所述试剂盒提取植物总DNA的方法，包括：将植物组织浸入缓冲液A中，沸水浴70～120s后，加入缓冲液B，混匀离心，取上清液即获得总DNA。

上述获得的上清液可直接作为PCR模板使用，并且PCR过程中，无须再向PCR体系中添加任何稳定剂和抗氧化剂。

作为优选，所述植物组织为新鲜叶片，叶片经打孔器打孔取样后再与缓冲液A混合。保证DNA提取较为均匀高效。

缓冲液A中仅含有NaOH，省掉了Tween20等其他物质，使得缓冲液A不会过于黏稠，便于保存，提DNA时不必每次都现配缓冲液A。

作为优选，所述缓冲液A为0.1M的NaOH水溶液。叶片与缓冲液A的混合比例优选为0.01g：65～85μl，更优选为0.01g：75μl。强碱条件下细胞更易破裂，从而促使细胞核中的染色体DNA释放。