[发明专利]一组特异识别β-银环蛇毒素的核酸适配体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物毒素技术领域，具体是指利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与β-银环蛇毒素高特异性结合的核酸适配体，为该核酸适配体在β-银环蛇毒素的检测和银环蛇咬伤的诊断中提供科学依据和理论基础。

背景技术

β-银环蛇毒素来源于银环蛇（Bungarus multicinctus）蛇毒中，是一种突触前多肽神经毒，表现出Ca²⁺依赖性磷脂酶A2（Phospholipase A₂，PLA₂）活性，是银环蛇毒的最主要的毒性成分，LD50（i.p.小鼠）为0.019μg/g。分子量（Mr）为20500，由两条链所构成，即A链和B链，并通过一对链间二硫键连接起来。分子量较大的A链（Mr=13500）含120个氨基酸,具有13个半胱氨酸，其一级结构十分类似于从蛇毒和哺乳动物胰腺中鉴定的PLA₂，具有比较弱的活性。分子量较小的B链（Mr=7000）由60个氨基酸组成，与蛋白激酶抑制物有一些序列同源性，作为β-银环蛇毒素对特定靶向细胞膜的识别亚基，在神经-肌肉接头突触前膜中的一些成分间相互作用上有着重要功能。当亚基间二硫键断裂时，或PLA₂活性中心被共价修饰时，都可导致β-银环蛇毒素的神经毒性和PLA₂活性的丧失。

蛇咬伤是热带、亚热带农村地区一个影响健康的重要问题，每年仅在亚洲，由蛇咬伤致死的人数就达5万人。银环蛇咬伤在我国占各类毒蛇咬伤的8.12%，居第5位，而死亡人数居首位。目前我国还没有一种快速、有效的蛇伤临床诊断试剂和方法，蛇伤诊断主要依靠病史和临床表现。由于被不同种类的毒蛇咬伤具有相似的症状，在病史不详的情况下，临床医生很难从患者的临床表现来判断倒底是被哪种毒蛇咬伤。

在蛇毒的实验室鉴定技术中，免疫检测是其中最主要的技术手段。现有的免疫诊断技术大多是利用多克隆抗体检测毒素，由于不同蛇毒多抗之间存在交叉反应，因此特异性较差。制备单个蛇毒成分的单克隆抗体可以大大提高检测的特异性，但单抗本身也存在一些缺陷。单抗相对于多抗的亲和力要弱，对酶标板的吸附性不够好，同时在进行酶或生物素标记的操作中稳定性也较差。

核酸适配体是能够与靶分子特异性结合的寡核苷酸序列（RNA或ssDNA）。1990年，Gold和Ellington两个研究小组几乎同时建立了一种制备特异性寡核苷酸分子的技术，并把该技术定义为SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数富集式配体系统进化)，可制备具有一定三维结构、能与靶分子通过立体构象之间的适应性互补(并非碱基配对)而高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子-适配体(aptamer)。SELEX技术的出现源于人们对核酸与蛋白相互作用研究的深入。单链核酸能通过链内某些互补碱基间的配对、静电作用、氢键作用等形成一些稳定的三维空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等。通过这些结构，单链核酸能够与蛋白质或其他分子形成具有高特异性结合力的稳定复合物。单链核酸还可以通过范德华力、氢键作用、静电作用和形状匹配等各种相互作用与靶分子产生高特异性的结合力。与抗体一样,核酸适配体与靶标结合同样具有高亲和力和特异性,因此,核酸适配体亦被称为“化学抗体”。

由于核酸适配体只是一段小的单链DNA或RNA，相对于抗体具有很多天然的优势。例如,核酸适体易于合成及能应用常规的化学方法进行修饰、长期的稳定性(如能长期维持可逆的变性和复性)、无毒性或免疫原性。从工程学的角度来看,与体内生物抗体产生过程不同,体外核酸适体的化学合成批次间的差异很小。所有这些因素都促进了核酸适配体广泛地应用于医学与生命科学等领域的研究和疾病的诊断与治疗中。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够与β-银环蛇毒素特异性结合的核酸适配体。

本发明的另一个目的在于提供上述核酸适配体在β-银环蛇毒素和银环蛇咬伤的检测中的应用。