[发明专利]一种林蛙皮胶原蛋白微粉的制备方法

说明书

技术领域：本发明涉及胶原蛋白的制备方法，尤其是涉及一种林蛙皮胶原蛋白微粉的制备方法。 

背景技术：

胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，是肌腱、软骨、皮肤和血管的主要成分，占蛋白质总量的25%～30%。胶原蛋白具有独特的三重螺旋结构，分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性。胶原蛋白在水、弱酸和弱碱中不降解，且在煮沸后变为可溶的单链结构的明胶，但由于胶原蛋白的分子量比明胶大，具有更高的生物活性，因此，胶原蛋白更适合生物组织利用，更易促进受损组织再生，缩短愈合过程。 

由于疯牛病和口蹄疫等动物传染性疾病全球肆虐，目前亟待寻找更高质量和更高安全性的未变性天然胶原蛋白的提取原材料。众所周知，水产动物比陆生动物在安全性上具有更大的优势，因此水产动物已经成为未变性天然胶原蛋白的优选原材料，其中，林蛙因其天然安全性成为优中之选。 

目前，在医用无纺布和美容产品中，作为生物活性物质添加的胶原蛋白粉，因提取原料较为复杂，难以保证安全性，且胶原蛋白粉颗粒体积较大，不易被人体皮肤吸收。 

发明内容：本发明的目的是为克服现有技术的缺点，旨在提供一种以林蛙皮为原料，制备胶原蛋白微粉的方法。根据本方法制备的林蛙皮胶原蛋白微粉的粒径范围为200nm—3000nm，颗粒体积小且粒度均匀，安全无毒、易于被人体皮肤吸收。 

本发明为解决技术问题而采用如下技术方案： 

1、一种林蛙皮胶原蛋白微粉的制备方法，其步骤如下： 

（1）林蛙皮胶原蛋白肽的制备 

①脱色：称取干燥林蛙皮，用水浸泡至舒展变软后，加入到0.05mol/L的NaOH水溶液和1%w/vH₂O₂水溶液的混合溶液中浸没静置其中NaOH水溶液与H₂O₂水溶液的体积比为1～3:1，搅拌，每2～4h更换一次混合溶液，直至溶液中无可见色素产生，将林蛙皮用蒸馏水清 洗，于25～45℃烘干； 

②脱脂：将烘干后的林蛙皮放入丙酮中浸没静置，恒温25±10℃，搅拌2～3d，期间每3-4h更换一次丙酮，以蒸馏水洗去林蛙皮上的残余脂肪； 

③酸酶提取：将脱脂、脱色处理后的林蛙皮放入0.5～1mol/L乙酸水溶液中，林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:100g/ml，并加入规格为3.000-3.500NFU/mg的胃蛋白酶，林蛙皮与胃蛋白酶的质量比为20～100:1，置于35±10℃恒温水浴中，搅拌24～96h，得林蛙皮的酸酶提取液； 

④乙二胺四乙酸灭酶活：向林蛙皮的酸酶提取液中加入乙二胺四乙酸，其中林蛙皮与乙二胺四乙酸质量比为33～167:1，静置1～10h； 

⑤离心：将静置后的林蛙皮酸酶提取液离心10～30min，转数为4000～10000r/min，合并收集上清液； 

⑥盐析：向上述上清液中加入NaCl，使NaCl浓度为4～5mol/L，搅拌12～24h后，静置12～24h，以转数5000～10000r/min离心20～40min，除去上清液，取沉淀溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中，其中每1L缓冲溶液含有NaCl1mol和三羟甲基氨基甲烷0.1mol，并加入HCl调节PH值至7.2～7.6，且林蛙皮与缓冲溶液的质量体积比1:20～50g/mL，向上述缓冲溶液加入NaCl，使NaCl的浓度为1.7～2.4mol/L，静置12h，以转数5000～10000r/min，离心30～60min，得沉淀； 

⑦透析：将上述沉淀溶于1%w/v乙酸水溶液中，且林蛙皮与乙酸水溶液的质量体积比为1:10～50g/mL，将乙酸水溶液装入透析袋中，再将透析袋浸入蒸馏水中透析3～7d，更换蒸馏水至其中无氯离子产生； 

⑧聚乙二醇20000浓缩：将上述透析袋埋到固体聚乙二醇20000中，更换浸湿的聚乙二醇20000，至透析袋中的溶液浓缩至原体积的1/2； 

⑨冷冻干燥：将上述浓缩后的溶液经预冻后，放入冻干机中真空冷冻干燥，制得林蛙皮胶原蛋白肽； 

（2）林蛙皮胶原蛋白微粉的制备 

①取林蛙皮胶原蛋白肽制成浓度为0.05～0.10g/ml的醋酸溶液，搅拌12h； 

②调节静电纺丝条件中的电压至15～20V、纺丝距离10～15cm、纺丝速度1～2ml/h，电纺得林蛙皮胶原蛋白纤维膜，用砂纸将该纤维膜从锡箔打磨下来，收集得林蛙皮胶原蛋白微粉。 

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：