[发明专利]基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及重组人胰岛素样生长因子（hIGF-1）基因的构建，属于分子生物学领域，具体地说是涉及一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌。

背景技术

胰岛素样生长因子 IGF-1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）是一类既具有促进细胞分化和增殖又具有胰岛素样作用的多肽，是人体本身含有的一种活性蛋白多肽物质，IGF-1在降血糖、降血脂、舒张血管、促生长、促细胞分化、创伤修复、抗肿瘤、心血管疾病和抗衰老等方面都有很重要的作用。鉴于IGF-1广泛而重要的生理功能，其合成与分泌的异常及系统功能的障碍会导致很多严重疾病，还有糖尿病；胰岛素抵抗综合症；侏儒症；心脑血管及神经系统疾病等多种顽疾也与IGF-1的生理功能息息相关，因此利用基因工程方法获得大量有生物学活性的IGF-1制品，对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。

但是，IGF-1的生产研究大部分实验都还处于实验室小规模阶段，主要是IGF-1生产时产量少，分离困难，产量低，价格昂贵（约100000元/克），这导致IGF-1的开发和利用受到严重影响。如何扩大IGF-1的产量，降低成本，已经成为迫在眉睫的工作。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，克服真核基因在原核宿主中表达量低的问题，本发明提供了一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，通过设计多种优化密码子序列，构建不同表达载体，制备多种表达菌株。

一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，所述工程菌为能在胞内表达或分泌表达重组人胰岛素样生长因子融合蛋白的基因工程菌，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，所述融合蛋白的氨基酸序列为Seq ID No：4所示。

优选地，所述工程菌包括含有所述高表达IGF-1基因的重组表达载体和表达菌株。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为未经优化的IGF-1人源原基因序列，其基因序列为Seq ID No：1所示。

优选地，所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列①，其基因序列为Seq ID No：2所示。

优选地，所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列②，其基因序列为Seq ID No：3所示。

优选地，所述的重组表达载体包括胞内表达载体和分泌表达载体。

优选地，所述胞内表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PGEX4T-1和PET32a的多克隆位点处得到的重组质粒，所述胞内表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。

优选地，所述分泌表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PET22b的多克隆位点处得到的重组质粒，所述分泌表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。

优选地，所述的大肠杆菌包括Escherichia coli BL21(DE3)、Rosetta(DE3)和Origami (DE3)。

优选地，所述表达菌株包括一株经偏好性改造的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍。该工程菌株为能高效表达融合蛋白的工程菌株。

不同物种在遗传密码子的使用频率上是不一致的，有些真核基因中出现频率很高的密码子在原核基因中却很少使用。本发明中依据大肠杆菌密码子使用频率表人工合成并克隆了适于在大肠杆菌中表达的 IGF-1基因，通过提高目的基因mRNA的转录来增加表达量，从本质上提高目的蛋白的表达。

本发明依据原核密码子使用频率表人工合成并克隆适于在大肠杆菌中表达的IGF-1基因，下文所述的目的基因（包括经偏好性改造的IGF-1基因和未经改造的人源原IGF-1基因）。

本发明中目的基因含有243个碱基，该243碱基序列能翻译出含有77个氨基酸的肽链。

本发明共设计3种表达IGF-1的密码子序列，构建9种重组表达载体以及筛选得27株工程菌。