[发明专利]一株壳聚糖酶产生菌及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

（二）背景技术

壳聚糖（Chitosan）为几丁质脱乙酰化后的产物，溶解性能较几丁质有很大提高，具有良好生物相容性。壳寡糖（Chito-oligosaccharide)一般是指2～10个聚合度的低糖，可通过壳聚糖水解制得，具有较低的分子量，呈水溶性，非常容易被人体吸收，作为一种功能性低聚糖，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、调节人体免疫及抗癌等功效，在医药、食品等领域中具有广泛的应用前景。

目前制备壳寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法，采用化学法降解寡糖得率低，产物分离困难，而且对环境污染严重。酶解法则具有反应条件温和，寡糖得率高，不造成环境污染等优点。壳聚糖水解酶主要有壳聚糖酶、N-乙酰葡萄糖胺酶以及非专一性水解酶等。壳聚糖酶是壳聚糖的专一性水解酶，能特异性将壳聚糖水解成聚合度为2～8的壳寡糖，是制备壳寡糖的主要研究方向。

壳聚糖具有广谱抗菌性，而且对人体无毒无副作用，不同分子量的壳聚糖的抗菌性能有所差异。如管云林等采用Staphylococcus aureus作为试验菌株，发现随壳聚糖的分子量降低抗菌性能增强，并由此提出了壳聚糖抗菌的两个模型。夏文水等采用Escherichia coli作为试验菌株，发现随分子量上升抑制菌效果逐渐下降，而且通过试验测定分子量为1500的壳寡糖抑菌效果最强。Keisuke U等报道平均分子量小于5000的壳聚糖对Staphylococcus aureus和Escherichia coli不仅没有抗菌作用，反而能促进细菌的生长，而分子量约9300的壳聚糖几乎可以完全抑制细菌生长。Yousook等报道分子量为4万的壳聚糖在浓度为0.5%时，对Staphylococcus aureus和Escherichia coli的杀灭率为90%，分子量为18万的壳聚糖在浓度为500ppm时，对Staphylococcus aureus和Escherichia coli的杀菌率几乎为100%。杨玉红曾报道相对分子质量分别为500、2100、3700、5200、9000的壳寡糖对Escherichia coli的抑制作用，发现相对分子质量2100的壳寡糖对大肠杆菌抗菌作用最强，其抑菌作用随壳寡糖质量浓度的增加而增强。

（三）发明内容

发明目的是提供经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，及其在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2014年3月19日，保藏编号：CCTCC No：M2014095。

本发明筛选到一株产壳聚糖酶菌株，对该菌株进行紫外诱变育种，经补料发酵培养，壳聚糖酶产量最大达4.86U/ml，并研究了采用该菌株产生的壳聚糖酶制备壳寡糖的可能性，测定了壳聚糖不同酶解时间产物的平均聚合度和分子量，考察了壳寡糖对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的抗菌性能，为专一性酶促生产壳寡糖打下基础。

本发明还涉及所述的Mitsuaria sp.GD02-M41在微生物酶解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明经筛选诱变获得的一株壳聚糖酶产生菌——Mitsuaria sp.GD02-M41产生的壳聚糖酶为内切酶，酶解壳聚糖后不产生氨基葡萄糖，相比于化学水解方式，能在更短时间内获得壳寡糖，且无污染、条件温和，具有良好的应用前景。

（四）附图说明

图1为Mitsuaria sp.GD02的系统发育树；

图2为水解时间对壳寡糖完全水解的影响；

图3为发酵时间对壳寡糖完全水解的影响；

图4为HCl浓度对壳寡糖完全水解的影响；

图5为TLC薄层层析；1，7：氨基葡萄糖标准品；2：酶解5min；3：酶解10min；4：酶解20min；5：酶解30min；6：酶解60min；

图6为壳聚糖/壳寡糖对大肠杆菌生长的影响；

图7为壳聚糖/壳寡糖对酵母菌生长的影响；