[发明专利]一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用。

背景技术：

斑鸠霉素（Ikarugamycin）属于多环tetramate大环内酰胺类化合物，其结构式如图1的式1所示，其具有独特5-6-5三环系统以及抗菌及抗肿瘤细胞等多种生物活性。目前斑鸠霉素已作为抗肿瘤先导化合物引起关注，相应的具体药理机制正在深入研究中。

近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为改造斑鸠霉素的生产菌Streptomyces sp.ZJ306带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。

迄今为止，有关珠江口源微生物中斑鸠霉素生物合成基因簇、类Michael环化反应酶等生物催化制备斑鸠霉素及基因敲除获得斑鸠霉素类似物等，国内外尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种斑鸠霉素的生物合成基因簇。

本发明是以珠江口沉积物源放线菌Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素为目标分子，在筛选到生物合成基因簇基础上，综合运用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学及有机化学相结合的技术，阐明了斑鸠霉素的生物合成机制，为利用组合生物合成方法修饰改造斑鸠霉素类似物提供依据，为药物筛选提供化合物实体。

本发明的斑鸠霉素生物合成基因簇来源于珠江口沉积物放线菌Streptomyces sp.ZJ306，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411-15678位的碱基序列所示，包括3个基因，具体为：

（1）负责斑鸠霉素的聚酮-鸟氨酸-聚酮骨架合成的基因，即ikaA，位于核苷酸序列（SEQ ID NO.1，下同）第3411-12785个碱基处，长度为9375个碱基对，编码杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶，3124个氨基酸；

（2）负责斑鸠霉素骨架合成修饰的另一个基因，即ikaB，位于核苷酸序列第12782-14614个碱基处，长度为1833个碱基对，编码FAD依赖的氧化还原酶，610个氨基酸；

（3）负责斑鸠霉素的还原型环化反应的基因，即ikaC，位于核苷酸序列第14614-15678个碱基处，长度1065个碱基对，编码乙醇脱氢酶，354个氨基酸。

SEQ ID NO.1（序列表）所示序列的第3411-15678位碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到，且第3411-15678位碱基序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应（PCR）或用合适的限制性内切酶酶切相应DNA或DNA重组技术获得。

本发明提供了构建至少包含部分SEQ ID NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段的重组DNA载体途径。

本发明还提供了创制斑鸠霉素生物合成基因被阻断或异源表达等其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含SEQ ID NO.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探针法或Southern杂交等技术，从其他生物体重筛选获得斑鸠霉素的生物合成基因簇同源基因。

本发明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于Streptomyces sp.ZJ306基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包括本发明中的部分序列，也包含Streptomyces sp.ZJ306基因组中邻近区域未克隆DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被体内外突变等修饰，包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通过合适表达系统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。

本发明提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。