[发明专利]无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域中的无乳链球菌BibA重组蛋白及其编码基因、制备方法和应用。 

背景技术

无乳链球菌是一种人畜共患病原菌，可感染人、奶牛、兔、罗非鱼、牛蛙等多种脊椎动物，人体医学上将无乳链球菌称为B群链球菌（GBS）。GBS能使带菌孕妇引发早产、晚期流产、胎儿发育不良、胎膜早破、子宫内膜炎、泌尿道感染等；无乳链球菌在奶牛上可引起奶牛的急性、亚急性和慢性乳房炎。 

目前无乳链球菌可分为10个血清型，临床研究表明，该菌存在耐药性逐年增强的趋势，所以疫苗预防该病成为科研工作者的首要目标。但目前研制无乳链球菌常规疫苗存在许多技术难点：1）无乳链球菌菌体灭活疫苗免疫保护效果有差异 ；2）血清型众多，不同血清型菌株之间交叉保护性差；3）目前已知的保护性抗原较少。因此，筛选和获得无乳链球菌的候选免疫蛋白成为研制奶牛乳房炎高效疫苗的关键技术问题。目前尚无关于无乳链球菌BibA蛋白用于疫苗候选蛋白的报道。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了可作为无乳链球菌基因工程疫苗候选蛋白的无乳链球菌BibA重组蛋白。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：无乳链球菌BibA重组蛋白，具有如序列2所示的蛋白序列。 

本发明的第二个目的是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因。 

进一步的，上述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因，是如下a）或b）的基因： 

a）其核苷酸序列是序列表中的序列1；

b）在严格条件下与a）限定的DNA序列杂交且编码所述无乳链球菌BibA重组蛋白的DNA分子。

本发明的第三个目的，是提供了含有上述无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因的重组表达质粒，所述重组表达质粒为pCold^TMⅠDNA-BibA。 

本发明的第四个目的，是提供了含有上述重组表达质粒的工程菌，所述工程菌为pCold^TMⅠ-BibA/BL21(DE3)。 

上述一种无乳链球菌BibA重组蛋白的制备方法，包括有以下步骤： 

1）获得如上所述的无乳链球菌BibA重组蛋白的编码基因；

2）将步骤1）得到的无乳链球菌BibA重组蛋白克隆入表达载体pCold^TMⅠDNA中，得到pCold^TMⅠ-BibA重组质粒；

3）将步骤2）得到的pCold^TMⅠ-BibA重组质粒导入宿主细胞E. coli BL21-DE3；

4）诱导表达得到无乳链球菌BibA重组蛋白。

本发明的第五个目的，是提供了上述无乳链球菌BibA重组蛋白作为基因工程疫苗研制过程中的候选蛋白的应用。 

具体操作步骤为：

（1）设计引物：

设计的BibA基因的表达引物对为：

上游引物BibA1： 5'-CGCGGATCCTCGGATTCAATTCCTCAT-3'（斜体下划线为BamHⅠ酶切位点），

下游引物BibA2： 5'-CGGAATTCTGCATAATATCCAGGTGTAGGC-3'（斜体下划线为EcoRⅠ酶切位点)；

（2）BibA基因的扩增与获得：

以提取的无乳链球菌基因组DNA为模板进行BibA基因的PCR扩增，反应体系为50.0μL：DNA模板6.0μL，上下游引物各1.0μL ，Premix Ex Taq 25.0μL，ddH₂O 17.0μL；PCR反应条件为：95℃预变性5 min、95℃变性1 min、64℃复性1 min、72℃延伸1 min，反应30个循环；72℃延伸10 min；