[发明专利]基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种从水稻中提取多聚核糖体的方法。

背景技术

多聚核糖体是指合成蛋白质时，多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上，形成的似念珠状结构。在合成多蛋白质时，核糖体并不是单独工作的，常以多聚核糖体的形式存在。在mRNA的起始密码子部位，核糖体亚基装配成完整的起始复合物，然后向mRNA的3’端移动，直到到达终止密码子处。当第一个核糖体离开起始密码子后，空出的起始密码子的位置足够与另一个核糖体结合时，第二个核糖体的小亚基就会结合上来，并装配成完整的起始复合物，开始蛋白质的合成。同样，第三个核糖体、第四个核糖体，依次结合到mRNA上形成多聚核糖体。在生物体将mRNA中的遗传信息翻译成有功能的蛋白质的过程里，该复合物起到了关键的作用。不同于转录组所体现的全部转录的总RNA包含了全部的翻译与非翻译的RNA，多聚核糖体中所结合的RNA全部都是会被最终翻译成蛋白质的mRNA，其分析结果将在转录组与蛋白组之间架起桥梁。

1963 年，Warner 等发现了细胞内的多聚核糖体的结构。2003 年，Arava 等利用多聚核糖体芯片技术研究了酵母全基因组范围内的mRNA翻译谱。随着二代测序技术的深入发展， Ingolia 等基于核糖体保护的 mRNA不被核糖核酸酶所降解而保留下来，而裸露的mRNA被消化的原理，获得基因组范围内核糖体覆盖的mRNA片段，并对这些片段进行深度测序，从而提出了全基因组范围内分析核糖体的分布情况，同时可以进一步在单核苷酸水平上分析蛋白质翻译事件的核糖体谱技术。可见多聚核糖体技术的产生和不断发展为蛋白质翻译事件、蛋白质组学、microRNA的作用原理以及分子机理研究提供了另一个维度上重要并且精确的手段。而精确高效地提取生物组织中的多聚核糖体是开展上述研究和分析的重要基础。

1998年有文献报道用镁离子沉淀多聚核糖体，只提取细胞质RNA。这样既减少了提取的总RNA中的其它成分，特别是核前体RNA和细胞器RNA的干扰，同时也浓缩了细胞中的mRNA。但本方法适合细胞来源较少时提取多聚核糖体。

目前使用较广泛的提取多聚核糖体的方法主要分为蔗糖密度梯度离心法和免疫沉淀法。蔗糖密度梯度离心法主要在对细胞进行破碎、过滤之后，将匀浆液加入蔗糖密度梯度溶液中，并使用超速离心仪进行离心分离。该方法虽然收率较高，但有着设备要求高，操作复杂的缺点。有文献报道使用垂直转头密度梯度超速离心法，快速分级分离多聚核糖体，但对仪器设备要求同样较高。

现有的免疫沉淀法在植物中的拟南芥中有应用，但该方法由于提取液配方的原因导致收率较低，不适合做后续的深入研究。而且有关从水稻组织中提取多聚核糖体的报道并不多，方法也不成熟，因此需要对提取水稻组织中提取多聚核糖体的方法进行改良。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出了一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，以解决以往提取多聚核糖体时对实验设备要求高，操作过程复杂，并且产物收率较低的问题。

本发明提出的基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，涉及一种过表达融合了Flag标签的核糖体蛋白RPL18的水稻植株，在此转基因植物体内得到Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，从而可以使用亲和层析的方法将此复合物富集起来。

具体步骤如下：

（一）首先，确定需要过表达的基因和水稻宿主。

所述的融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18在水稻中有6个基因编码，其中3个属RPL18A，另外三个属RPL18B，选取OsRPL18B1(Os03g0341100)（SEQ.ID.NO.1）、OsRPL18B2(Os05g0155100)（SEQ.ID.NO.2）两个基因添加标签。

所述的水稻宿主为日本晴。

其次，构建植物表达载体，并转化水稻。

所述的过表达植株通过构建融合Flag标签的OsRPL18B1(Os03g0341100)、OsRPL18B2(Os05g0155100)植物表达载体，分别转入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S启动子及Ω-HF增强子的启动下实现过表达。

然后，鉴定过表达植物中的核糖体-mRNA复合物。

所述的Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物通过对获得的转基因株系进行GUS染色及western blot鉴定。