[发明专利]瓜类细菌性果斑病菌LAMP检测引物

说明书

(一)技术领域

本发明涉瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)LAMP引物及检测方法，属于生物技术领域。

(二)背景技术

瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch，BFB)是西甜瓜等葫芦科作物上重要的细菌病害，由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起。该病为典型的种传病害(Schaad N W，1978)，发病后侵染叶片、果实和种子，严重影响果实的品质和产量，对瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁(Richard Latin，1995；Walcott R R，2003)，上世纪90年代在我国首次报道，随后在新疆、海南、内蒙古、宁夏、北京、河北、山东、吉林、福建、湖南等地发生，并呈上升趋势，造成大田西瓜和甜瓜减产甚至绝收，给西甜瓜生产带来巨大损失(蔡学清等，2005；薛莉等，2009；任小平等，2010；胡俊等,2006；赵廷昌等,2001；金岩等,2004)。因此建立西瓜噬酸菌的快速、准确、便捷的检测技术是防止该病害发生的重要举措。

有关西瓜噬酸菌国内外已有多篇PCR特异性检测的研究报道(Minsavage G V et al，1995；Walcott et al，2000；Schaad N W et al，2003；Song W Y et al，2003；Bahar et al，2008)，但均存在诸如灵敏度不高或特异性不强等缺点。目前，一种最新的检测技术开始被广泛应用一环介导等温扩增法(LAMP)。环介导等温扩增技术是由NOTOMI等于2000年报道的一种新型核酸扩增技术，它针对目的基因其特点是针对靶序列的6个特异性区域设计两对引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下(65℃左右)保温30～60min，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生(Notomi et al，2000)。此方法的产生后，已被广泛应用于病毒、细菌、原生动物和真菌等领域的检测中(Endo et al，2004；Okafuji et al，2005)。

本实验基于LAMP技术建立了瓜类细菌性果斑病菌的检测体系，并对市售的瓜种子进行了检测。

参考文献

1.Bahar,O.，Efrat,M.，Hadar,E.et al.2008.New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection of Acidovorax citrulli[J].Plant Pathol.，57：754-763.

2.Endo S，Komori T，Ricci G，Sano A，et al.2004.Detection of gp43 of Paracoccidioides brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method[J].FEMS Microbiol Lett，234：93-97.

3.Minsavage，G.V.，Hoover，R.J.，Kucharek，T.A.，1995.Detection of the watermelon fruit blotch pathogen on seeds with the polymerase chain reaction[J].Phytopathology，84(4)：470-474.

4.Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated is othermal am plifi cat ion of DNA[J].Nuclei c Acids Res，2000，28(12)：E63.

5.Okafuji T，Yoshida N，Fujino M，Motegi Y，Ihara T，Ota Y，Notomi T，Nakayama T.2005.Rapid diagnostic method for detection of mumps virus genome by loop-mediated isothermal amplification.J Clin Microbiol 43：1625-1631.