[发明专利]一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法，属于病原检测技术领域。

（二）背景技术

坦布苏病毒感染是我国于2010年新发生的一种传染性疾病，2010年春夏之交，江浙地区突然出现鸭产蛋下降，之后迅速波及福建、广东、广西、安徽、江苏、江西、河南、山东、河北和北京等地的鸭场，经过病原分离和系统的实验室诊断，该病的病原为黄病毒属中的坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）。

黄病毒属(Flavivirus)是一大群具有包膜的单正链RNA病毒，黄病毒科（Flaviviridae）包括3个病毒属，即黄病毒属（flavivirus）、瘟病毒属（pestivirus）和丙型肝炎病毒属（hepacivirus），共有60多种病毒。目前，研究表明，引起鸭感染发病的为黄病毒科、黄病毒属中的的坦布苏病毒。

本病夏秋季发生更严重，蛋鸭、肉鸭生产区均有发生；危害多个品种，包括蛋鸭中的绍兴鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、金定鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭，肉种鸭中的樱桃谷鸭和北京鸭，野鸭等；该病发病率高，死亡率较低，一般在5%以下，有继发感染时也可高达30%。10～25日龄肉鸭和产蛋鸭更易感。鹅、鸡也有发病的报道。该病一年四季均可发生，但夏秋季节多发，冬季也能发生。发病率80%以上，死亡率在2%～10%，TMUV属蚊传虫媒病毒，可能会经蚊子传播；已从鸭场内死亡麻雀体内检出TMUV，提示病毒可经鸟类传播；带毒蚊子和麻雀可导致病原在不同鸭场间的传播。病鸭组织样品中，卵泡膜的检出率最高，达93%，提示TMUV是否会经卵垂直传播，应该进行研究和引起重视。从泄殖腔拭子也可分离到病毒，表明该病毒可经粪便排毒，从而污染环境、饲料、饮水、器具、运输工具等。带毒鸭在不同地区的调运（或者污染的运输工具）极易成为本病大范围和快速传播的渠道。饲养管理不良，气候突变能促进该病的发生。

目前，针对鸭坦布苏病毒已建立的检测方法主要是分子生物学检测方法，如套式RT-PCR、LAMP、地高辛、荧光定量PCR等，尚无血清学方法检测坦布苏病毒的相关报道。

（三）发明内容

为了解决上述问题，以便于更简便、快速地对大量样品进行TMUV病毒的检测，本发明提供了一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法。

本发明首次用血清学方法进行坦布苏病毒的检测。与现有技术相比，本发明更适合于基层进行大规模的病原检测，是一种简便，快速，特异的双抗体夹心ELISA方法。

一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法，包括以下步骤：

1、单克隆抗体制备

使用坦布苏病毒作为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，待抗体效价达到10⁴以上三天后，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG法进行细胞融合，间接ELISA法检测抗体并筛选阳性杂交瘤细胞，杂交瘤细胞制备的腹水单克隆抗体用辛酸-硫酸铵方法纯化，用1×pH9.6碳酸盐缓冲液将单抗溶液稀释为2μg/mL。

2、酶标抗体的选择

利用高碘酸钠法对步骤1）中稀释为2μg/mL的单抗溶液进行HRP标记，并利用ELISA法对HRP标记的单抗溶液进行活性鉴定。鉴定步骤：将步骤1）中稀释为2μg/mL的单抗溶液包被96孔ELISA板，以坦布苏病毒为抗原，以酶标（HRP）抗体为标记抗体，进行ELISA试验，测定各孔反应液OD_450nm值。以OD_450nm值最高的为酶标抗体。

3、ELISA检测程序

e1包被将步骤1）中浓度为2μg/mL的单抗溶液按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；

e2洗板包被的酶标板按照200μL/孔加入PBST稀释液，震荡洗涤5min，重复四次，甩干。

e3封闭e2甩干的酶标板按照200μL/孔加入PBST封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干。

e4加样将待检样品按照100μL/孔加入封闭后甩干的酶标板，置于37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干。

e5检测抗体将步骤2）中酶标抗体用PBST稀释液按照体积比1:1000稀释后，按照100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干。

e6TMB显色加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光显色15min。