[发明专利]EHD2抗体及其在制备乳腺癌免疫组化检测试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是EHD2的表达与亚细胞定位与乳腺癌患者的生存具有显著相关性，可以作为乳腺癌恶性度诊断和预后预判的一个分子指标。

背景技术

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤。全世界每年有一百万妇女患病，自20世纪70年代末开始、我国乳腺癌的发病率一直居女性肿瘤的首位。北美、北欧原是乳腺癌的高发区，现在我国的发病率也从五年前的十万分之十七增加到去年的十万分之五十二，呈快速上升趋势，而且发病年龄也越来越年轻化，年龄最小的只有十四岁。引发乳腺癌的因素是多方面的，除遗传因素外还有环境因素、精神因素及工作压力太大等因素。而且经济越发达的城市发病率越高于农村。目前世界各国投入较大的精力和物力来研究该病的发生、发展，以便采取积极的预防措施。

目前在临床上对肿瘤的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力，准确率可达50%-75%。然而，这种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据，因此亟需与现代分子技术相结合，才能提高判断的准确性和特异性，特别是为个体化治疗路径与方案的选择提供理论依据。

虽然肿瘤的发生与多种因素相关，但最终的根源主要来自于基因水平的异常变化，包括基因的扩增、突变、缺失、异位等等，导致维持细胞正常生理状态所需的多个功能蛋白在表达水平的高低、生化活性的强弱、甚至亚细胞结构分布等方面产生变化，当这种变化赋予了细胞无限增殖能力及转移能力，并不能被体内外保护机制逆转或杀灭时，便产生了肿瘤。因此，对肿瘤恶性本质的深刻认识和有效控制的前提是明确这些功能蛋白分子的异变情况，这需要借助免疫组织化学的手段。

免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分子抗原的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子、同位素等)的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原(多肽和蛋白质)的表达量及其亚细胞定位。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。比如雌激素受体ER、孕激素受体PR和表皮生长因子受体家族的Her2已经被广泛用于乳腺癌的临床分子病理诊断，它对乳腺癌的病理分类和临床用药起到了积极的指导作用。这些成果离不开肿瘤基础研究的进步，并期待新的分子指标被进一步揭示和纳入临床应用，不断提高肿瘤诊治水平。EHD2基因及其编码蛋白即可能是这种新的分子指标。

EHD2(Epsin homology(EH)-domain-containing proteins)属于EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的EH结构域，此EH结构域是一个含有约一百个氨基酸残基的片段，早先发现于EGFR的激酶底物Eps15(Epdemal Growth Factor Receptor Pathway Substrate Clone15)。EHD2参与胞膜转运的各步调控，包括内转及前、后内含体的过渡和调控循环通路；膜及膜蛋白的各路调节，包括消化降解及循环再生。是整个胞膜转运机制的必不可少的重要环节，对在各种细胞活动中维护物料传输信号传导的动态平衡起着关键的作用，它的失调将导致信号应答失当，细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。

中国文献“EHD2干扰影响永生化乳腺上皮细胞的增殖和迁移”（王洪玉等，中国肿瘤临床，2011年第38卷第11期，）公开了在乳腺肿瘤中EHD2的基因表达失调下降，提示该基因可能是一个新的乳腺抑癌基因。然而在进一步免疫组化研究中我们发现，虽然EHD2在总体表达量上呈现下降的趋势，但这种趋势主要在核中；相反，细胞浆中的表达却有升高的趋势。而且，EHD2在核中的表达水平与患者的生存情况密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床预后情况。

现有的商业化EHD2抗体有十余种，由主流抗体试剂公司Santa Cruz和Abcam等提供，但是均属于基础研究用试剂，没有依据表明这些抗体可以和我们的抗体一样具有合格的特异性并可用于免疫组化检测，特别是目前尚没有任何其它EHD2抗体经过大量组织标本的免疫组化验证并显示出可以通过对EHD2的亚细胞异常定位检测来达到对肿瘤的恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的。与本专利申请抗体相比它们有如下缺陷：