[发明专利]高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。

背景技术

柠檬酸是一种非常重要的有机酸，广泛应用于食品工业和日化行业等。目前工业上使用发酵法生产柠檬酸。高产柠檬酸菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，几十年来柠檬酸生产菌种黑曲霉的选育研究一直是研究人员关注的焦点。

1940年美国科学家克雷伯斯提出三羧循环（TCA循环）学说，柠檬酸的发酵机理逐渐得到认识。含糖类原料生成柠檬酸的生化转化过程中，葡萄糖通过糖酵解途径（EMP途径）生成丙酮酸，丙酮酸进一步氧化脱羧生成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A和草酰乙酸（由丙酮酸羧化所生成）缩合成为柠檬酸。

柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，柠檬酸合成酶活性很高时，有利于柠檬酸的大量合成和积累。

黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶首先将含有淀粉的原料转变为葡萄糖，葡萄糖经过EMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸由丙酮酸氧化酶生成乙酰辅酶A和CO₂，继而乙酰辅酶A与草酰乙酸在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用合成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子、同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的α-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，三羧酸循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬酸大量合成和积累并排出菌体外，其理论反应式为：

C₆H₁₂O₆+1.5O₂→C₆H₈O₇+2H₂O

柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。

柠檬酸菌种的优劣对于柠檬酸产量和生产成本起到重要作用，要实现高产柠檬酸发酵，降低生产成本，柠檬酸菌种的驯化和选育是关键。一株优良的柠檬酸菌种应具备耐高酸和产高酸的性能。本发明以黑曲霉菌株FY2010为出发菌种（ACCC30161），从发酵良好产酸高的薯干醪柠檬酸发酵液中分离菌株，通过一系列物理和化学诱变、酸度驯化得到58株耐酸菌株，再复筛得到9株既耐酸又产酸高的菌株，进一步优筛得到1株耐酸、产酸高、高糖酸转化率的优良菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产柠檬酸黑曲霉菌FY2013及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一株高产柠檬酸黑曲霉（Aspergillus niger）FY2013，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.8832，保藏日期2014年2月20日。

本发明还提供所述黑曲霉FY2013的部分基因组序列，见SEQ ID No.59。

其全基因组序列共含34853277个核苷酸。GC含量28.18%，包括313个预测的开放阅读框（ORF）。

本发明还提供所述黑曲霉FY2013在发酵生产柠檬酸中的应用，包括以下步骤：

1）种曲制备：

取5mL无菌水至黑曲霉菌株FY2013的培养平板上，用接种环刮下孢子至200mL无菌水中，制成孢子悬液，用于柠檬酸种子罐培养；

2）种子罐培养：