[发明专利]基于胞外多糖水解酶的工程菌及其实现方法

权利要求书

1.一种基于胞外多糖水解酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为外源表达胞外多糖水解酶的DH5α大肠杆菌；

所述的胞外多糖水解酶具体为β-1,4-胞外多糖水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的β-1,4-胞外多糖水解酶具有Sg-Hyd基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其长度为714个碱基对，共编码237个氨基酸，切除前33个氨基酸信号肽序列后的成熟蛋白加入起始氨基酸M共205个氨基酸，分子量为22.0KD。

2.根据权利要求1所述的工程菌的实现方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计并合成PCR引物，自灰略红链霉菌JSD-1（CGMCC NO.5706）基因组DNA为模板进行PCR扩增；

正向引物Hyd-NdeⅠ-F:

5'-GGAATTCCATATGGCCGTCTGGAACTCCTGCGACCAGTGG-3'

反向引物Hyd-EcoRⅠ-R:

5'-GGAATTCTCAGCCGCCCGAGACGGTCAGGCTGTC-3'

2）构建具有Sg-Hyd基因的质粒：将步骤1得到的PCR扩增产物切胶回收后连接至克隆载体，并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞；挑取具有相应抗性的克隆并通过菌落PCR进行鉴定，直至获得阳性克隆后挑取并摇菌提取得到pET-30a质粒；

3）构建具有Sg-Hyd基因的表达载体；

4）将表达载体转化至大肠杆菌：将步骤3中得到的含有Sg-Hyd基因的表达载体质粒转入Transetta感受态细胞内，通过具有卡那霉素抗性和氯霉素的LB液体培养基进行筛选获得阳性克隆，即含有Sg-Hyd基因的工程菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增采用PrimeSTAR GXL高保真酶进行扩增，PCR扩增条件为：98℃预变性3min；98℃变形10s，68℃延伸1min；30个循环后68℃终延伸3min。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤3具体包括：

3.1)用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切处理含有Sg-Hyd基因的克隆质粒后通过琼脂糖凝胶电泳回收含有Sg-Hyd基因的片段；

3.2)用NdeⅠ和EcoRⅠ内切酶处理pET-30a质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳回收载体片段；

3.3)将两次回收的DNA片段混合，在T4DNA Ligase的作用下过夜连接，然后导入DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆并扩大培养提取其质粒，获得含有Sg-Hyd基因的表达载体。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的克隆载体采用pEASY-Blunt Simple Cloning Vector。