[发明专利]一株产苹果酸基因工程菌及其构建及应用

权利要求书

1.一株产苹果酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA043（Escherichia coli BA043），其保藏登记号为CCTCC NO：M 2014034。

2.根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA043的构建方法，其特征在于以缺失乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）的菌株 NZN111为出发菌株，利用同源重组技术进一步敲除富马酸酶基因（fumB）和富马酸还原酶基因（frdABCD）活性，并共表达外源丙酮酸羧化酶基因（pyc）和烟酸磷酸核糖转移酶基因（pncB），得到产苹果酸的大肠埃希氏菌BA043。

3.如权利要求2所述的构建方法，其具体构建步骤如下：

 步骤一，以缺失乳酸脱氢酶基因（ldhA）和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性的大肠杆菌菌株NZN111为出发菌株，敲除其中的富马酸酶基因（fumB）和富马酸还原酶基因（frdABCD），得到同时缺乏ldhA、pflB、fumB和frdABCD活性的感受态菌株；

步骤二，纯化扩增出丙酮酸羧化酶基因（pyc），构建得到表达丙酮酸羧化酶的表达质粒；

步骤三，纯化扩增出烟酸磷酸核糖转移酶基因（pncB），连接到步骤二所述的重组质粒上，构建得到共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶的表达质粒；

步骤四，将步骤三中所得质粒导入到步骤一中得到的感受态细胞中，获得阳性转化子；

步骤五，利用步骤四的阳性转化子共表达丙酮酸羧化酶和烟酸磷酸核糖转移酶，恢复其在厌氧条件下代谢葡萄糖的能力，同时，减少丙酮酸的积累，得到产苹果酸的基因工程菌大肠埃希氏菌BA043。

4.利用权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA043发酵生产苹果酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

5.根据权利要求4所述的大肠埃希氏菌BA043发酵生产苹果酸的方法，其特征在于：按体积比1% 的接种量从冻存管接入三角瓶中有氧培养，当有氧培养菌体OD₆₀₀至3~4 左右，浓缩3倍至OD₆₀₀=9左右转接至30mL LB的血清瓶中，同时添加0.3 mM 的IPTG作为诱导剂，0.5mM 烟酸作为NAD(H)底物厌氧发酵。