[发明专利]检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法

说明书

技术领域

  本发明属于生物检测、生物化学领域，具体涉及一种快速检测登革病毒及其四种血清分型的方法，提供特异性引物和探针。 

背景技术

 登革热是登革病毒感染引起，由蚊媒传播的急性传染病，是世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病。临床表现为高热、头痛、肌肉、骨关节剧烈酸痛、皮疹、淋巴结肿大、白细胞计数减少等，广泛流行于热带和亚热带地区的，以与中国接壤的东南亚国家最为严重。随着境外旅游、商务的发展，人口流动性增加，缺乏有效疫苗及治疗措施，登革热已经成为世界性的严重公共卫生问题。因此需要快速、灵敏的方法用于在感染过程中的早期对登革热感染进行检测以进行更好的进行病人管理。 

在对登革病毒检测方面，目前主要有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等方法。但这些方法或多或少存在一些缺陷：病毒分离不仅对样本有严格的要求，在技术上要求高，且获得病原学诊断结果至少需要１周，无法实现早期诊断病例的目的。而用血清免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还存在与其他黄病毒之间存在交叉反应。在核酸检测方法方面，RT-PCR方法及荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但大多方法基于单一血清型，在对临床样本进行检测时，无法对样本同时进行四种血清型检测，但仍然存在通量低的缺点。 

对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。 

基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。它包含有直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等优点。 

综上所述，采用多重PCR技术联合液相芯片技术，对登革病毒进行分型检测，不失为一种直观、准确、快速、适合早期诊断的检测手段。然而，现有的登革热病毒体外检测试剂盒或提供的引物、探针，或特异性和灵敏性较低，或存在假阳性结果，或检测步骤繁琐、检测条件设置复杂，因此，设计检测步骤简单、成本低、灵敏度及特异性高的方法及特异性及灵敏度高、且有利于实验条件设置的引物、探针，对提高检测登革病毒及其分型的方法的稳定性、准确性和实用性有重要意义，成为目前一直需要改进的问题之一。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供检测登革病毒及其分型的引物、探针及方法，    利用聚合酶链反应（PCR）结合核酸杂交技术，进一步利用多重反转录聚合酶链反应（RT-PCR）结合液相芯片技术对登革病毒及其分型进行特异性检测。 

为解决上述问题，本发明首先提供用于引导登革病毒基因反转录的引物，所述引物至少包括如下一条： 

用于引导登革I型病毒基因反转录的引物DV1-RTP，其序列为SEQ ID No：1所示；

用于引导登革Ⅱ型病毒基因反转录的引物DV2-RTP，其序列为SEQ ID No：2所示；

用于引导登革Ⅲ型病毒基因反转录的引物DV3-RTP，其序列为SEQ ID No：3所示；

用于引导登革Ⅳ型病毒基因反转录的引物DV4-RTP，其序列为SEQ ID No：4所示。

第二，本发明还提供用于扩增登革病毒目的片段的引物，所述引物至少包括如下一对：