[发明专利]一种磷酸化麝香蛸素的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸化麝香蛸素的纯化方法，属化学纯化技术领域，主要为磷酸化多肽在医药等领域的有效应用提供条件。 

背景技术

麝香蛸素(Eledoisin)是从麝香蛸(Eledone)中提取得到的含11个氨基酸的多肽，其序列为Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂，具有强烈的外周血管舒张及增加冠脉血流量的作用，是已知肽类中最有效的降压物质，其效应比硝酸甘油强数千倍。磷酸化麝香蛸素是将其N端第3位Ser磷酸化后得到的，序列为Pyr-Pro-Ser(PO₃H)-Lys-Asp-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂，其活性比麝香蛸素高两倍多(一种强效降压磷酸肽及其制备方法，申请号：201410118129.2)，降压持续时间延长1倍左右。因此磷酸化麝香蛸素将在医药领域具有良好应用前景。但由于其存在纯化难的问题，限制了其有效应用。目前磷酸化麝香蛸素主要通过化学法合成，虽然磷酸化麝香蛸素比麝香蛸素只多了一个磷酸基团，但要大量制备磷酸化麝香蛸素纯品的难度大为增加，原因：一是磷酸化麝香蛸素的化学合成产率较低，副产物较多；二是色谱法中最常用的反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)，每次纯化的量有限(<100mg)，纯化过程非常费时费力；三是磷酸化麝香蛸素与其对应的非磷酸化麝香蛸素在最常用的色谱分离中行为非常相似，导致RP-HPLC很难将其分离。因此，要得到磷酸化麝香蛸素的纯品，尤其是大量制备，是一项非常重要而又困难的工作。 

针对磷酸化多肽的分析水平的纯化，除了色谱法外，目前发展的技术主要有固相金属亲和色谱(IMAC)和金属氧化物富集法。近期，金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注，如二氧化钛(TiO₂)和二氧化锆(ZrO₂)等。2004年Pinkse等(“Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns”，《Analytical Chemistry》，P3935-3943，2004年)将二氧化钛技术引进磷酸化蛋白质组学领域，并建立了TiO₂为预分离的2D-NanoLC-ESI-MS/MS技术平台。近期利用TiO₂富集磷酸肽的文献亦有报道，并证明了二氧化钛对磷酸肽富集的高效性(“A novel titanium dioxide-polydimethylsiloxane plate for phosphopeptide enrichment and mass spectrometry analysis”，《Analytica Chimica Acta》，P105-113，2014年)。但目前已报道的技术主要在蛋白质组学领域中对生物样本中的天然磷酸化多肽进行微量相对富集(申请号 201310253448.X，200810202189.7，200810211727.9)，以便提高磷酸化多肽在质谱中的检出率，尚停留在分析水平的纯化，无法满足化学法合成的磷酸化多肽的大量纯化的要求，特别是磷酸化麝香蛸素的纯化方法尚未见报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能用于化学合成的磷酸化麝香蛸素的高选择性、高特异性的纯化方法，为磷酸化麝香蛸素在医药等领域的应用提供条件。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

利用二氧化钛与磷酸根在酸性环境中存在较强的路易斯酸碱作用，在碱性环境中路易斯酸碱作用消失的原理并结合自主研发的一种磷酸化多肽的纯化装置(申请号：201420158316.9)而实现的。首先将二氧化钛装填到一种磷酸化多肽的纯化装置中，并在酸性环境下，将磷酸化麝香蛸素加入纯化玻璃管中，由于酸性条件下二氧化钛表现为路易斯酸，钛原子将与磷酸根阴离子结合，起到特异性吸附磷酸化麝香蛸素的目的；然后用酸性较低的清洗液将没有被吸附的非磷酸化多肽和杂质去除；清洗完后，利用碱性环境下二氧化钛表现为路易斯碱，失去与磷酸根作用的特点，因此加入碱性溶液，便可洗脱得到纯品磷酸化麝香蛸素，从而实现化学合成磷酸化麝香蛸素的纯化。具体步骤如下：