[发明专利]一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种胃液中幽门螺杆菌多重实时荧光定量（Real Time）PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

1983年澳大利亚学者Warren和Marshall首次从人胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylroi，简称H.pylori或HP），是一种呈S形或弧形弯曲的革兰氏阴性菌。研究表明，HP感染与慢性胃炎、胃溃疡、胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴瘤有着密切的联系。1994年国际癌症研究中心（international agency for research on cancer，IARC）将HP列为Ⅰ类致癌物。流行病学调查显示，HP感染在世界各地均较为常见，具有很高的发病率。我国HP感染率40%-90%，平均59%。因此，HP感染的快速准确诊断对于下一步针对性的临床治疗具有重要意义。

目前HP感染的检测主要分为侵入性和非侵入性两类。（1）侵入性检查：通过内窥镜获取胃粘膜组织作为实验材料，进行微生物学培养、病理组织学检测、快速尿素酶试验和基因诊断等；（2）非侵入性检查：不需获得胃粘膜组织，采用胃液、血清、唾液、粪便等标本，方法有粪便幽门螺杆菌抗原检测、血清中幽门螺杆菌抗体检测、尿素呼气试验和其他标本中幽门螺杆菌基因的测定。以上方法各有利弊，侵入性检查方法在儿童不易接受及普及，非侵入性检查方法中，粪便抗原检测对于已经进行临床治疗的病例，不能得到满意的结果；尿素呼气试验中，尿素酶的活性常受口咽部尿素酶阳性细菌的影响；由于幽门螺杆菌感染后数周血中才会出现特异抗体，且细菌根除后血中抗体可维持6个月以上，因此血清幽门螺杆菌抗体检测不主张用于临床诊断。

实时荧光定量PCR因其高灵敏度和高特异性的特点被广泛应用于各种病原体的检测，该方法能够有效控制PCR产物的实验室污染，更适合临床实验室常规检测。目前，没有报道针对胃液标本的实时荧光定量PCR的成熟、系统的检测方法。本发明旨在提供一种通过实时荧光定量PCR方法从胃液标本中检测HP的感染情况，包括胃液标本的预处理方法以及检测所需最小胃液量。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种实时荧光定量PCR检测胃液中幽门螺杆菌的方法，该方法仅需10-500μL的胃液，即可快速、准确、灵敏地检测出胃液中幽门螺杆菌的存在。

为实现上述目的，本发明通过对GenBank中已知幽门螺杆菌核苷酸序列的比对分析，找到幽门螺杆菌的cag PAI上的一段保守区cagH作为靶基因。这段基因的筛选来源于中国CDC传染病所诊断室对全国来源的74株HP菌株的cagPAI测序分析。这些菌株代表了中国的流行菌株。同时本发明选择人上皮细胞核糖核酸酶P（Rnase P）作为内参基因。Rnase P基因常被用作从人体标本中检测病原微生物的内参基因。这一基因的成功扩增，可以保证试验中模板提取的正确性和初步估计模板的浓度。

幽门螺杆菌特异性引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，与之配套的特异性探针序列如SEQ ID NO:3所示。Rnase P内参基因引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，与之配套的特异性探针序列如SEQ ID NO:6所示。

所述用于实时荧光定量检测幽门螺杆菌的引物的核苷酸序列为：

HP cag H上游引物：5’-TTATGTTAGAAATCGCTTGAGTGTCA-3’（SEQ ID NO:1）

HP cag H下游引物：5’-CGCTTCTCAAATGATACTTAATCAATC-3’（SEQ ID NO:2）

与上述引物配合使用的探针核苷酸序列为：

HP cag H荧光探针：5’-FAM-AGGTGCTAGTAGCTAATC-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)

该探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BHQ

所述用于实时荧光定量检测Rnase P内参基因的引物的核苷酸序列为：

RnaseP上游引物：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’(SEQ ID NO:4)

RnaseP下游引物：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’(SEQ ID NO:5)

与上述引物配合使用的探针核苷酸序列为：