[发明专利]一种动态实时测量细胞膜电位的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动态实时测量细胞膜电位的方法。

背景技术

人体体液流动会对细胞会产生剪应力，进而引起细胞电位的变化。剪切力能影响人体内皮细胞生物学特性的许多方面，与多种心血管疾病相关。因此，检测细胞膜电位是否变化具有重要的生理学和病理学研究意义。

目前，测量剪切力下的细胞膜电位的方法主要包括荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法。

荧光染料法是利用荧光强度在剪切力作用下会发生改变，并且与膜片钳得到的细胞膜电位变化趋势相同的性质，来测量细胞膜电位的一种方法。但这种方法反应时间和精度都有较大差距，且目前无法证明荧光强度能够代替细胞膜电位表征细胞的电生理现象。

微电极阵列法采用集成电路硅工艺，通过微电极阵列能够表征大体积的单个肌细胞或神经细胞的动作电位。但这种方法存在测量准备时间长、测量准确度和灵敏度低的缺点。

膜片钳方法是目前最常用的方法，它是通过玻璃微电极测量单细胞的膜内外的电压或电流差，并通过一定的放大和转换，得到细胞膜电位。但是这种技术具有以下先天性不足：生物组织是由大量细胞紧密排列形成的，而膜片钳只能测量单细胞，并不能表征实际的多细胞膜电位对剪切力的响应情况；测量时会破坏细胞膜，改变细胞的特性，短时间内细胞将死亡，这样就限制了对细胞膜动作电位以及离子通道早期发生现象的研究；在流体环境下测试时，由于剪切力的存在，细胞容易从膜片钳脱落；膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），每天只能获得的数据量仅为几到几十个，耗时耗力。

综上所述，荧光染料法、微电极阵列法和膜片钳方法均无法解决活体多细胞膜电位的测量问题，来准确表征剪切力对细胞膜电位的影响。

因此，需要一种具有检测快速、灵敏度高、实时测量、结果准确、生物兼容性高、多细胞活体测量等多重优点的方法，来进行细胞膜电位的测量。

发明内容

因此，为解决现有技术中存在的上述问题而完成了本发明，本发明的目的之一在于提供一种实时的准确测量剪切力影响的活体多细胞膜电位的方法，该方法使用了氮化镓（GaN）高电子迁移率晶体管（HEMT）、微流室技术和微注射泵技术，将从人体脐带静脉血中分离出来的细胞在体外进行培养，然后注入到微流室中继续进行培养，最后利用微注射泵在微流室中进行精确的流量控制，用微流室内的HEMT器件测量流体表面的粘滞度，进而计算出细胞膜电位，实现了一种动态模拟多细胞环境并实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位的方法。

在使用本发明测量细胞膜电位的过程中，将作为生物传感器的HEMT器件和微流室、微注射泵、储液瓶相连，在微注射泵提供动态流体环境的前提下，通过HEMT器件实时监测流体环境下的活体多细胞膜电位。

本发明中应用于生物传感器的HEMT器件的结构为：底层为蓝宝石材料，底层向上依次为1.6μm左右的GaN缓冲层，1.2nm AlN插入层，8～15nm左右的AlGaN势垒层和1.5nm GaN帽层，势垒层铝组分在25%～40%之间。帽层以上为Si₃N₄钝化层，钝化层中间被蚀刻出一块长方形槽状的裸栅区域，裸栅区域无电极引出，尺寸在10μm～10mm范围内。

如本领域技术人员所熟知或容易想到的上述HEMT器件的蓝宝石衬底也可采用其他具有相似功能的材料，如碳化硅（SiC）材料。

本发明中HEMT器件的制造工艺为：

（1）台面刻蚀，采用ICP方法刻蚀异质结材料形成器件的台面隔离；

（2）淀积源漏极欧姆金属，采用电子束蒸发的方法获得欧姆金属层，欧姆金属采用Ti/Al/Ni/Au四层结构，并在830℃下退火形成合金，获得良好的源漏极欧姆接触；

（3）采用PECVD方法淀积Si₃N₄材料作为钝化层；

（4）光刻并采用ICP方法刻蚀Si₃N₄，露出裸栅区域。