[发明专利]CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA

权利要求书

1.在CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征为：

（1）所述sgRNA在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶序列符合5’-GGN(19)GG、5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG的序列排列规则；

（2）所述sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的ORF；

（3）所述sgRNA在HBV cccDNA的上的靶序列是唯一的。

2.如权利要求1所述的在CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA中用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA，其特征为：其序列如序列表SEQ ID NO. 30-33任意一条序列所示。

3.CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为包括如下步骤：

（1）权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，在其对应DNA序列的5’加上CCGG，如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G，合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；权利要求1-2任意一项所述的sgRNA，获得其对应DNA序列的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

（2）线性化序列如序列表SEQ ID NO. 12所示的pGL3-U6-sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得pGL3-U6-HBV sg质粒； pGL3-U6-HBV sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选阳性克隆并用序列如序列表SEQ ID NO. 11所示的通用引物U6测序的方法鉴定出阳性克隆；37°C摇床摇阳性克隆菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit（AP-MN-P-250）抽提pGL3-U6-HBV sg质粒；

（3）用脂质体装载pGL3-U6-HBV sg质粒和序列为SEQ ID NO. 13的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒，共转染携带乙型肝炎病毒cccDNA的细胞；

（4）用T7EN1 酶切检测和TA克隆测序确认乙型肝炎病毒cccDNA已经被敲除。

4.如权利要求3所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（3）所述的脂质体为Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent。

5.如权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，其特征为：步骤（1）所述的sgRNA其序列为序列表SEQ ID NO. 30-33任意一条所示，分别对应的步骤（2）和（3）所述的pGL3-U6-HBV sg质粒的序列为序列表SEQ ID NO. 16-19任意一条序列所示，即sgRNA序列为SEQ ID NO. 30对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 16，sgRNA序列为SEQ ID NO. 31对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 17，sgRNA序列为SEQ ID NO. 32对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 18，sgRNA序列为SEQ ID NO. 33对应的pGL3-U6-HBV sg质粒为SEQ ID NO. 19。

6.在如权利要求5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法中用到的pGL3-U6-HBV sg质粒，其特征为序列如序列表SEQ ID NO. 16-19任意一条所示。