[发明专利]一种大量获得干净、无损伤受精卵的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种大量获得干净、无损伤受精卵的方法。

背景技术

玫瑰无须鲃（Puntius conchonius）俗称玫瑰鲫，属于鲤形目、鲤科、鲃亚科、无须鲃属，体长为6-10 cm,是一种原产于印度、巴基斯坦和尼泊尔等南亚国家的小型淡水硬骨鱼。由于玫瑰无须鲃具有较多的优点，近年来，用玫瑰无须鲃取代斑马鱼作为模式动物，已被广泛应用于胚胎发育、生物毒理学检测等方面，也可作为一种观赏鱼饲养。在进行胚胎发育研究时，无论是用斑马鱼还是其他实验动物，其产卵后用吸管从培养容器的底部抽取受精卵，在这一过程中都会对受精卵或早期胚胎产生不利影响，甚至会对其产生损伤。

授权公告号CN 100388880C（申请号200510042441.9）的中国专利文献公开了一种获得大菱鲆鲜优质受精卵的方法，包括亲鱼培育和人工采卵授精两方面。亲鱼的培育：包括亲鱼的优选及培育条件、亲鱼的饲料及饲喂、亲鱼的水温、光照调控；人工采卵授精：包括人工采卵和人工授精操作。本发明从大菱虾亲鱼的培育到人工采卵授精，是一套完整的综合控制技术方法，通过关键环节技术措施的掌握，可提高卵子的活卵率和受精成功率，获得优质的受精卵。

授权公告号CN 101831400 B（申请号200910047280.0）的中国专利文献公开了青鳉鱼受精卵收集及分离方法，涉及鱼类受精卵分离技术，需要解决的技术问题是提供一种收集分离青鳄鱼受精卵可避免刺破卵膜的方法，本发明的技术方案采用柔软小抄网……。

申请公布号CN 102613120 A（申请号201210109858.2）的中国专利文献公开了一种黄姑鱼优质受精卵的获得方法，属于农业海水养殉技术领域。其包括1）亲鱼的培育；2)受精卵的采收；3)优质受精卵的分离。本发明提供黄姑鱼优质受精卵的获得方法，制定一套完整的亲鱼培育技术，通过对关键环节技术措施的掌握，来提高卵子的活卵率和受精成功率，最终获得优质的受精卵，优质受精卵达到91%以上，孵化率达到93%以上。

就上述专利而言，都是粗放型的操作，没有关注受精卵的干净程度与污染情况，通过人工授精获得受精卵，以渔业生产为主要目的。如果把青鳉作为实验中的模式动物，其受精卵的收集及分离方法太繁琐，而且青鳉鱼作为实验动物存在较多的不足，不仅个体太小，产卵数量太少，且产卵的方式很特殊，单个受精卵的分离太难，分离时必然会对受精卵产生不良影响，甚至损伤，很难作为一种通用技术和实验技术推广。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种大量获得干净、无损伤受精卵的方法，本方法既能满足胚胎发育研究的实验要求，又能做为产业化水产养殖的借鉴，具有较高的科研与应用价值。

本发明的方案是：一种大量获得干净、无损伤受精卵的方法，其步骤如下：

1. 准备培养缸

选择大小适中的培养缸（优选的，50×25×25 cm），向培养缸中添加准备好的曝气自来水，放置一层隔离网，距离培养缸底12-15 cm，网眼的大小（优选的，网眼直径为2.5-3 mm）要确保鱼卵能顺利漏下，而实验用鱼不能游出，培养缸设置加热（24～26℃）及充气（溶解氧5.0 mg/L以上）设备，放置一周后再放入实验用鱼。

2. 准备实验用鱼

把性成熟和身体健壮的玫瑰无须鲃雌、雄成鱼（5-20对）按1:1的性别比放入培养缸的隔离网中，人工控制光照周期（L:D＝14:10），光照强度为50～100 Lx，每天喂食冷冻赤虫2次（喂食量为鱼体重的0.3-0.8％），一周后用于受精卵的采集。

3. 采集受精卵

实验前一天，准备好取卵用的培养皿（优选的，直径为10-12 cm），当晚22时将实验用鱼缸置于黑暗中，直到次日早晨8点改用自然光照，光照10分钟后，根据需要把培养皿放入隔离网下面，用于收集受精卵。再过10分钟就会出现鱼的追尾现象，并开始自然产卵、受精，产卵、受精10 min后，取出培养皿，去除多余的水，用0.03％的碘盐水冲洗，即可得到干净、无损伤的受精卵。

对各个培养皿中的受精卵进行记数，并放入设置好的不同环境中进行培养、观察及实验研究。

前面所述的方法，优选的方案是，第一步骤培养缸规格为50×25×25 cm。

前面所述的方法，优选的方案是，第一步骤曝气自来水添加量为培养缸容量的70-80%（优选75%）。

前面所述的方法，优选的方案是，第二步骤控制光照周期为L:D＝14:10）。