[发明专利]一种荧光微球免疫层析试纸条的制备及定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体是涉及一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法。

技术背景

在生物和医学检测中，经常用到免疫分析法，它包括放射免疫分析、酶联免疫分析及免疫层析等方法。放射免疫分析和酶联免疫分析法需要昂贵的设备、专业的操作人员和复杂的操作步骤，难以快速得到检测结果。免疫层析法因操作简单、快速和成本底，而常用于快速定性或半定量检测，如盐酸克伦特罗、乙肝表面抗原、黄曲霉毒素和促黄体激素等胶体金试纸条。目前我国艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等常见传染性疾病的发病率不断上升，给社会和人民生活安全造成极大隐患。而基于免疫层析技术的产品因操作简便、快速和只需肉眼观察或简单仪器就能显示结果，可作为疾病或违禁添加物检测的初步筛选方法。因此，开发基于免疫层析技术的产品有利于缓解目前我国心血管疾病、艾滋病、乙肝、丙肝和梅毒等常见传染性疾病发病率日益上升的情况。

免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异、高亲和性的免疫反应。层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接利用可目测的标记物(如胶体金)所看到的直观的实验现象(如显色)而获得测定结果。而游离标记物(即未与待测物结合的标记物)则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但胶体金免疫层析技术尚存在以下不足：

(1)胶体金标记过程是静电吸附过程，属于物理吸附，在液相中稳定性较差，己标记上的蛋白分子容易再次脱落。

(2)只有当金颗粒达到一定量时，肉眼才能分辨出检测条带与背景差异，因而检测灵敏度不高。

(3)不同的材料基质效应明显，背景干扰非常大。

(4)胶体金免疫层析技术一般用于定性或半定量检测。

胶体金免疫层析技术检测灵敏度较低，在实际检测中只能对检测测物定性或半定量，无法准确定量。目前，己有相关专利报道了以荧光纳米微粒为标记物进行免疫层析检测，如公开号为CN1645146A的专利公开了一种用荧光稀土纳米颗粒作为标记物的免疫层析方法及其检测试纸条的制备。公开号为CN1866012A的专利公开了一种定量、快速的免疫检测方法及其专用装置，该方法将荧光物质鳌合物Eu³⁺、sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺与有机高分子纳米微粒结合，制备成荧光微粒，通过荧光检测来进行定量。这些专利公开的方法都能提高免疫层析检测的灵敏度，但报道的荧光纳米颗粒存在一定的缺陷，如染料容易泄露、抗溶液干扰能力差等，从而应用范围在很大程度上受到了限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、简便和快速的荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测的方法。本发明使用的荧光微球不受外界环境的影响，因而荧光稳定，为通过荧光进行定量检测提供了良好的条件。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)荧光微球垫的制备：称取0.009g过硫酸钾，0.004g NaHCO₃溶于7ml去离子水水中，将一定质量的荧光染料溶于2ml无水乙醇及1ml苯乙烯后，加入到水溶液中，摇匀，通氮气5min，放入70℃恒温水浴震摇24h后，取出，离心(10000rpm×10min)分离出的聚合物分别用乙醇、去离子水离心洗涤3次，即得到聚苯乙烯荧光微球。用制备的荧光微球来标记抗体、抗原或其它特异性结合物质，并将其喷涂在玻璃纤维膜上。

(2)硝酸纤维素膜(NC膜)的制备：将抗体、抗原或其它特异性结合物质包被到硝酸纤维素膜上制成检测区，将另一种抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上制成质控区。

(3)组装和剪切：在粘性底板上依次搭接地粘贴：滤纸、样本垫、荧光微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，并剪切成适当宽度即成为免疫层析试纸条。

所述荧光微球直径为30-150nm

所述活性基团为-CHO、-COOH、-OH、-NH：或-SH

所述荧光物质为有机钉化合物、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明、6-梭基荧光素酞胺酷、荧光烷衍生物类、1，8-蔡二酞亚胺类、香豆素类有机荧光染料或其掺杂物以及量子点