[发明专利]一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。

3.权利要求1所述的含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体，其步骤如下：

1）、表达载体的构建：

根据氨基酸序列SEQ ID No:1，用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPX1突变体蛋白的基因，确保靶基因的5′端含有起始密码子ATG，3′端含有终止密码子，且两端都含有特定的酶切位点，确保靶基因的49位硒代半胱氨酸SeCys的编码序列替换为半胱氨酸Cys的密码子，第87位丙氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子，且基因全长不含有ACA序列；然后用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPX1突变体基因和分泌型原核表达载体，再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPX1突变体基因组装到分泌型原核表达载体上；所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPX1突变体基因中不存在的任何一个酶切位点，是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列；

2）、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：

用步骤1）中构建的含有GPX1突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳性菌株；再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF质粒转化阳性菌株，用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里，经IPTG低温4-25℃诱导表达，营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys，直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPX1突变体，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里，而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA，抑制宿主蛋白质的表达；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽GSH亲和层析纯化GPX1突变体蛋白，透析冻干后即得GPX1突变体蛋白纯品，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE和蛋白印迹Western blot鉴定目标蛋白。

4.权利要求2所述的含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体的制备方法，其特征在于：是在序列SEQ ID No:2的氨基端引入pColdI原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成序列SEQ ID No:5。