[发明专利]一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针及其制备方法和用途。

背景技术

硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸二硫化物氧化还原蛋白酶家族成员。硫氧还蛋白还原酶、硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide，NADPH)共同构成了硫氧还蛋白系统，该系统主要作用是调节细胞内氧化还原平衡。大量研究表明硫氧还蛋白还原酶在多种人原发性肿瘤中过表达，是肿瘤异常增生的关键调控酶，可以作为肿瘤标志物检测其在人体内的活性，从而监测体内肿瘤的发生和发展。因此一种能特异性检测硫氧还蛋白还原酶表达量的荧光探针有十分重要的临床意义。

硫氧还蛋白还原酶的活性位点是碳端一段保守的序列(-Gly-Cys-Sec-Gly)，其中Cys497，Sec498对其还原活性起到关键作用。大量文献表明，许多含有α，β-不饱和酮结构的化合物能抑制硫氧还蛋白还原酶的活性。姜黄素作为一种被广泛研究的化合物，依赖它结构中的α，β-不饱和酮，表现出较好的硫氧还蛋白还原酶抑制活性。其抑制作用机制是姜黄素分子通过迈克尔加成反应共价结合到该酶的Cys497，Sec498。本课题组从事硫氧还蛋白还原酶抑制剂的研究多年，通过大量结构的分析，发现呋喃丙烯酰结构是硫氧还蛋白还原酶抑制的药效团。

目前，文献报道只有一种含有环状二硫键的荧光探针分子用于检测硫氧还蛋白还原酶。然而，该荧光探针是非共价结合的。因此一种新的能共价结合到硫氧还蛋白还原酶，实现原位定点检测的荧光探针将会有更广泛的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可与硫氧还蛋白还原酶共价结合，具有较高检测特异性的硫氧还蛋白还原酶荧光探针。

本发明采用的技术方案是提供一种硫氧还蛋白还原酶荧光探针，所述荧光探针为(E)-7-(二乙胺基)-3-(3-(5-甲基呋喃-2-基)丙烯酰)-2氢-苯并吡喃-2-酮，其结构式为：

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：4-二已胺基水杨醛用溶剂溶解后，加入乙酰乙酸乙酯和哌啶，搅拌并加热回流，冷却后过滤获得中间体化合物；

步骤二：取所述中间体化合物，用溶剂溶解后，加入5-甲基呋喃醛及哌啶，搅拌并加热回流，冷却后柱层析分离获得所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针。

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针应用于检测硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的活性、含量。

本发明的目的还在于提供所述硫氧还蛋白还原酶荧光探针的用途，将所述荧光探针应用于制备硫氧还蛋白还原酶及同家族酶、同工酶、结构相似酶的检测试剂、检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）以呋喃丙烯酰基为药效团，以香豆素作为荧光团而设计的荧光探针，对于硫氧还蛋白还原酶作用的专一性强。

（2）本发明荧光探针自身荧光信号很弱，与硫氧还蛋白还原酶作用后荧光显著增强，并且，该荧光探针能与硫氧还蛋白还原酶共价结合，荧光不会被稀释，检测灵敏度高。

（3）本发明硫氧还蛋白酶还原酶自身化学性质稳定，无自氧化作用，与目标物作用迅速且作用后无光漂白现象。

（4）本发明所提供制备方法合成路线简单，易于制备，便于推广应用。

本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针性能优异，为进一步研究细胞中硫氧还蛋白还原酶生物学功能提供了可靠实用的工具。

附图说明

图1为本发明硫氧还蛋白还原酶荧光探针检测原理示意图；

图2为本发明实施例3中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶反应的紫外可见吸收光谱图；

图3为本发明实施例4中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同浓度的硫氧还蛋白还原酶反应的荧光发射光谱图；

图4为本发明实施例5中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与不同物质作用的荧光强度变化柱状图；

图5为本发明实施例6中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与硫氧还蛋白还原酶及其它含巯基化合物反应的荧光强度的动力学曲线图；

图6为本发明实施例7中硫氧还蛋白还原酶荧光探针与待检测细胞内硫氧还蛋白还原酶的荧光成像图。

具体实施方式