[发明专利]鉴定脆性组氨酸三联体(Fhit)相互作用的方法及其用途

说明书

本申请是申请日为2008年10月27日、申请号为200880119206.9的同名申请的分案申请。

对相关申请的交叉引用和关于资助研究的声明

本发明要求2007年10月26日提交的临时专利申请序列第60/000,480号的权益。本发明是在NCI资助号CA77738和CA78890的政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。

发明背景

FHIT基因包括染色体3p14.2的最具活性的常见的脆性位点(1，2)。由于等位基因丢失、基因组重排、启动子超甲基化或其组合，Fhit表达在大多数类型的人肿瘤的大部分中是丢失的或降低的(3，4)。Fhit敲除小鼠显示对癌症发展的增加的易感性(5，6)，并且FHIT基因治疗在暴露于致癌原的Fhit-缺陷小鼠中预防肿瘤(7，8)。癌细胞中通过稳定转染的Fhit恢复在体外几乎没有作用，除非将细胞暴露于应激，包括体内裸小鼠环境应激(9)；病毒介导的Fhit恢复，一种同时提供应激和Fhit表达的过程，在体内遏制肿瘤发生并在体外触发许多类型的恶性细胞的凋亡(10－13)，所述恶性细胞包括肺癌细胞。

在肺增生病变中，DNA损伤关卡基因(checkpoint gene)已经被激活，导致关卡蛋白中突变的选择和肿瘤进展(14、15)。FHIT内FRA3B处的DNA改变的证据伴随增生和关卡激活。在其他抑制基因的表达发生病理变化或改变之前，FHIT等位基因的丢失发生于吸烟者的正常外观的支气管上皮细胞中(16－18)。

Fhit表达受到暴露于DNA损伤剂的下调(19)，并且Fhit在对此类剂的应答中起作用(20，21)，而Fhit-缺陷细胞逃避凋亡并积累突变。

虽然Fhit表达在几种实验模型中通过涉及外在和内在凋亡途径的半胱天冬酶(caspase)依赖性机制触发凋亡，但是关于此过程的早期事件以及Fhit丢失如何参与肿瘤启动仍知之甚少。

因此，存在对在需要其的受治疗者中改变FHIT表达的方法的需要。还存在对可用于在需要其的受治疗者中改变FHIT表达的组合物的需要。

发明概述

在广泛的方面，提供了鉴定直接与Fhit相互作用以影响终点为凋亡的下游信号途径的蛋白的方法。在一个实施方案中，在用AdFHIT-His6病毒感染肺癌细胞之后，细胞内的蛋白被化学交联。鉴定并表征了与Fhit连接的蛋白和受它们影响的途径。

在另一广泛的方面，本文提供了诊断受治疗者是否具有癌症相关疾患或处于发展所述疾患的风险的方法，该方法包括测量受治疗者的测试样品中至少脆性组氨酸三联体(Fhit)基因的水平，其中相对于对照样品中对应的Fhit基因产物的水平，测试样品中所述Fhit基因产物的水平的改变指示受治疗者具有癌症相关疾患或处于发展所述疾患的风险。

当根据附图理解下列优选实施方案详述时，本发明的各种目标和优点将对本领域技术人员是明显的。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公布的拷贝将在提出请求并支付必要的费用后由美国专利商标局提供。

图1A-1H-Fhit蛋白在胞质溶胶和线粒体中的亚细胞定位。

图1A，以抗Fhit血清对用PonA处理48h的H1299细胞(D1)进行免疫荧光显微术；使用异硫氰酸荧光素(绿色)-轭合的抗兔免疫球蛋白(IgG)检测Fhit染色；鉴定线粒体的Mito-Tracker Red染色显示与Fhit的部分共定位。第四个图(右下方)中的黄色显示共定位点。

图1B，以penta-His抗体进行的A549AdFHIT(左)或AdFHIT-His₆-感染的细胞(右)的免疫电子显微术显示Fhit的线粒体定位(右)；以AdFHIT感染的A549细胞充当对照并显示仅有少量分散的粒状物(左图)。

图1C，使用抗Fhit对AdFHIT-感染的A549亚细胞级分的免疫印迹分析表明胞质溶胶、膜、细胞骨架和线粒体中的Fhit蛋白分布。

图1D，对用碳酸钠(图1E)和浓度增加的毛地黄皂苷(图1F)处理后AdFHIT-His₆感染的A549细胞的线粒体蛋白的免疫印迹分析表明，Fhit主要分布于线粒体基质中；用Fhit和CoxIV抗血清探测滤膜；图1F中的泳道代表用0%、0.10%、0.15%和0.20%毛地黄皂苷处理后的上清液。