[发明专利]一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法

说明书

本专利申请是中国专利“高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法”的分案申请，原申请的申请日为：2013-07-18，原申请的申请号为：201310302778.3，原申请的公布号为：CN103320406A。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含有两个以上催化基团的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法。

背景技术

含硒的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的底物是谷胱甘肽（GSH），催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）一起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用，它以底物GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清除体内活性氧（ROS），防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了能清除ROS外，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差，致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。

小分子模拟物主要有PZ51（ebselen）、AL3823A、BXT系列产品，它们的弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶（中国专利94102481.4和96112628.0）和以谷胱甘肽硫转移酶（GST）为蛋白模板制备的GPX模拟酶，其活力显著高于小分子模拟物。显然，以具有谷胱甘肽（GSH）结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果，因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点，对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有：用化学法（中国专利94102481.4，96112628.0）或营养缺陷型原核表达系统（中国专利200810050556.6）在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。

中国专利94102481.4，96112628.0，99104234.4，200810050556.6公开的各类含硒抗体酶的制备方法就是应用化学突变（修饰）法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys，有以下缺点：(1)在制备过程中，仅化学突变（修饰）这一步就会损失20-40%的酶蛋白，导致模拟酶产率显著下降；(2)制备模拟酶的周期长，操作繁琐，时间长；(3)在化学突变过程中需使用苯甲基磺酰氟、乙腈等，这些物质为有毒性的物质；(4)缺乏靶向性，对于大的蛋白分子而言，一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团，因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。

中国专利200810050556.6也公开了人源单链含硒抗体酶的另一种制备方法是用营养缺陷型原核表达系统（大肠杆菌）和基因突变法引入催化基团，但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备，不包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）突变体及其它GPX模拟酶的制备方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法（Yu,H.J.,Liu,J.Q.,A.,Li,J.,Luo,G.M.,and Shen,J.C.J.Biol.Chem.2005,280,11930-11935）亦见报道，这种方法虽然也采用营养缺陷型原核表达系统和基因突变法引入催化基团，但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶，不包括以天然GPX为模板制备GPX突变体。用营养缺陷型原核表达系统在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。

然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团，因此很难找到理想而准确的催化基团的位置；同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体，因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备GPX突变体则可克服这些缺点。由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子，在普通原核表达系统中，需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子，而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变，进而影响酶活性。因此普通原核表达系统不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。

发明内容