[发明专利]产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株及构建方法。

背景技术

L-丙氨酸作为人体非必需氨基酸，在生物体内由甘氨酸的氨基转移至丙酮酸而成。L-丙氨酸是一种白色结晶或结晶性粉末，带有甜味，易溶于水，在食品及医药工业领域具有广泛的用途。在食品工业领域，L-丙氨酸可提高食品的营养价值，加入L-丙氨酸后能够明显提高食品及饮料中蛋白质利用率。L-丙氨酸能够改善人工合成甜味剂的味感，使其如同天然甜味剂。另外，L-丙氨酸还能够改善有机酸的酸味，使其更接近自然味道。在医药领域，L-丙氨酸常被用作氨基酸类营养药，同时L-丙氨酸也是制造维生素B6、合成泛酸钙和其他有机化合物的重要原料。

目前，L-丙氨酸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。其中化学合成法主要有丙酸氯化氨化法、α-溴丙酸氯化法和氰醇法。这些方法都需要石油基原材料，如丙酸、α-溴丙酸、乙醛和氢氰酸等，因此成本受困于原油价格。随着石油价格的提升，成本会越来越高。另外，这些方法都是经过复杂的化学催化完成的，污染重，分离提取成本高，不适合可持续发展的需要。

生物法生产L-丙氨酸目前主要是以L-天冬氨酸为原料，在天冬氨酸-β-脱羧酶的催化下进行脱羧反应生产L-丙氨酸。该方法是目前国内L-丙氨酸生产厂家主要使用的生产技术。但是由于该方法中的原材料天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本依旧依赖于石油价格。随着石油资源的匮乏和价格的提升，顺酐资源的紧张和价格上涨将导致天冬氨酸的供给存在巨大的隐患，从而会影响到L-丙氨酸的生产及成本。

随着合成生物学和代谢工程的发展，近年来使用微生物发酵法生产L-丙氨酸的研究越来越受到重视。微生物发酵法能够实现以葡萄糖等糖类为原料生产L-丙氨酸。葡萄糖属于可再生的生物质资源，可以通过广泛存在于自然界中的木质纤维素降解获得。因此，使用其作为原材料，能够使L-丙氨酸的生产成本保持在稳定的水平，具有长远的经济优势。目前，已经有多株能够生产L-丙氨酸的菌株的报道。Smith等构建了一株E.coli ALS929(pTrc99A-alaD)菌株，其中在质粒中表达的丙氨酸脱氢酶AlaD能够将胞内生成的丙酮酸转化为L-丙氨酸，该菌株经过48小时发酵后，能够生产88g/L的L-丙氨酸。Lee等构建了一株E.coli ALA887(pTrc99A-alaD)菌株，发酵生产时能够在27小时内生产32g/L的L-丙氨酸。在这些菌株中，丙氨酸脱氢酶是生产L-丙氨酸的关键步骤，在报道的菌株中，编码该蛋白的基因一般是通过高拷贝质粒进行表达的。在进行菌株培养基发酵过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传。这些因素将导致发酵过程工艺复杂并提高L-丙氨酸生产的成本。因此，随着合成生物学和代谢工程的发展，构建遗传稳定的L-丙氨酸生产菌株并经过微生物发酵法生产L-丙氨酸将是未来的发展趋势。

目前菌株发酵生产L-丙氨酸使用的都是由蒸馏水配置的培养基，蒸馏水在工业生产中提高了生产的成本。开发能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵生产L-丙氨酸的菌株并用于生产，将极大的降低L-丙氨酸的生产成本。但是相对于蒸馏水，自来水中存在大量的离子并且浓度较高。为了获得能够直接使用自来水配置的培养基进行发酵的菌株，需要提高菌株对高离子浓度的耐受力。

发明内容

本发明的一个目的是提供产L-丙氨酸且耐受自来水的菌株的构建方法。

本发明提供的构建重组菌（XZ-A45）的方法，包括如下步骤：将出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白的编码基因，得到的重组菌；

所述clpA*蛋白的氨基酸序列为将所述clpA蛋白氨基酸序列的第632位异亮氨酸I突变为丝氨酸S。

上述方法中，所述clpA*蛋白为由序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸编码的蛋白。

上述方法中，所述clpA*蛋白编码基因为将所述clpA蛋白编码基因核苷酸序列第1895位的碱基为T突变为G得到的基因。

上述方法中，所述clpA*蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第1-2272位核苷酸。

上述方法中，所述将出发菌染色体上的clpA蛋白编码基因替换为clpA*蛋白编码基因为将含有所述clpA*蛋白编码基因的DNA片段Ⅱ同源重组到所述出发菌中。

上述方法中，所述DNA片段Ⅱ的核苷酸序列为序列表中序列2。