[发明专利]一种液相芯片检测动物源食品中硝基呋喃类代谢物的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫及食品公共卫生检测技术领域，尤其涉及一种液相芯片检测动物源食品中硝基呋喃类代谢物的方法。

背景技术

呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、和呋喃它酮是一类广谱抗生素，曾被许多国家用作杀菌剂、驱虫剂及动物生长促进剂。研究表明呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、和呋喃它酮在动物体内极不稳定，几个小时后便被代谢为相应的代谢产物1-氨基乙内酰脲（1-aminohydanto，AHD）、氨基脲（semicarbazide，SEM）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）及5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，AMOZ），而大部分代谢产物与动物组织蛋白稳定结合并长期存在于动物体内，该类药物及其代谢物具有严重的致癌等毒副作用。

鉴于此种情况美国、欧盟、中国、日本等国家在20世纪90年代初便相继做出了禁止使用硝基呋喃类药物（呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮）的规定。很多国家对此四种代谢物的最高残留限量做出了明确规定，如日本、欧盟等国家规定水产品、蜂蜜等动物源性食品中硝基呋喃类代谢物的最大残留限量为1μg/kg，我国也对其应用做了明确规定，但是由于其良好的抗菌效果，部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用此类药物的现象仍然存在。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液相芯片检测动物源食品中硝基呋喃类代谢物的方法，旨在实现对AHD、SEM、AOZ和AMOZ的快速检测。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，为兽药多残留快速检测技术研究奠定了基础；该方法的建立可满足动物源性食品中AHD、SEM、AOZ和AMOZ准确快速检测的要求，同时为我国动物源性食品中兽药残留的日常监控提供一种新的检测方法。

本发明是这样实现的，一种液相芯片检测动物源食品中硝基呋喃类代谢物的方法，包括以下步骤：

（1）将四种不同编码的微球与硝基呋喃类代谢物AHD、SEM、AOZ和AMOZ人工抗原进行耦联反应得到耦联微球；

（2）将四种AHD、SEM、AOZ和AMOZ单克隆抗体与BNHS溶液进行生物素化反应得到生物素化抗体；

（3）将硝基呋喃类代谢物、耦联微球、生物素化抗体以及链霉亲和素-藻红蛋白反应得到各待检测液，最后检测反应液平均荧光强度值以及进行数据分析。

优选地，在步骤（1）中，所述微球在与硝基呋喃类代谢物耦联反应前，先经过预处理为0.05M的MES中含有100μL微球的悬浮微球液，400μL所述悬浮微球液与5μg硝基呋喃类代谢物人工抗原混匀后37℃进行耦联反应2～3h，将反应液做杂质去除处理后，得到浓度为2000个/μL的耦联微球。

优选地，所述悬浮微球液的制备包括：将100μL预处理后的荧光微球用400μL、0.1M、pH6.2的磷酸缓冲液重悬，再依次加入10μL、50mg/mL的Sulfo-NHS和10μL、50mg/ml的EDC，混匀后37℃作用20min，得到包被微球；离心去上清，再用900μL、0.05M的MES重新悬浮，离心去上清，用三蒸水洗涤微球两次，再用400μL、0.05M的MES重悬微球。

优选地，所述荧光微球的预处理包括：将4℃保存的微球放置于室温20～30min，涡旋2～3min，吸取100μL荧光微球加入到离心管中，13000r/min离心4min去除保护液，用三蒸水洗涤后，用400μL、0.1M、pH6.2的磷酸缓冲液重悬微球。

优选地，所述将反应液做杂质去除处理包括：将反应液离心去上清，加入900μLPBS-TBN重悬微球，混匀后离心去上清，三蒸水洗涤微球两次，加入200μLPBS-TBN重悬微球；其中，所述PBS-TBN包括0.05%Tween-20、0.1%BSA以及含有0.05%叠氮钠的0.01MPBS。

优选地，在步骤（1）中，所述微球以聚苯乙烯为基质，且在微球中掺入了红色和橙色两种荧光染料，所述两种染料各有10种不同区分；

在步骤（1）中，所述耦联反应2～3h期间每隔15min涡旋混匀一次。

优选地，在步骤（2）中，所述生物素化反应包括：将硝基呋喃类代谢物的单克隆抗体各取1mg分别加入到45μL、10mM的BNHS溶液中，在室温、搅拌条件下进行生物素化反应4～5h，将反应液做杂质去除处理后，得到生物素化抗体。