[发明专利]用于适配子筛选的DNA双链分离方法以及适配子筛选方法和新的适配子

权利要求书

1.一种用于核酸适配子筛选中DNA双链的分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)取由生物素-链亲合素-磁珠法及碱变性法获得的FITC-ssDNA亚文库溶液用酸进行中和；

2)将步骤1)所得中和后溶液进行高分辨率琼脂糖电泳；

3)分离ssDNA亚文库及其中的污染序列，切取ssDNA亚文库的目标条带，通过小分子量DNA纯化回收试剂盒进行回收，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤1)中的酸选自盐酸或醋酸溶液；所述酸的浓度范围为50mM-300mM；优选盐酸的浓度为100mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤2)所述高分辨琼脂糖电泳的条件为：分辨率为20-1000bp，温度为室温，电泳时间为30min-1h，电压为150-180v。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤3)中的小分子纯化试剂盒为20bp-100bp分子量范围的小分子DNA纯化试剂盒。

5.一种包含权利要求1-4任一所述方法的核酸适配子的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法还包括由生物素-链亲合素-磁珠法及碱变性法获得的FITC-ssDNA亚文库溶液按以下步骤制得：

1-1)准备随机ssDNA文库，FITC标记的正向引物和Biotin标记的反向引物；

1-2)取靶向细胞与随机ssDNA文库进行孵育，然后收集含有与靶向细胞结合的ssDNA；

1-3)取上述与靶向细胞结合的ssDNA与非靶细胞进行孵育，收集与非靶细胞不结合的ssDNA进行PCR扩增，得到dsDNA；

1-4)取dsDNA与固定有链亲合素的磁珠进行孵育，然后加入碱性溶液即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤1-1)中，

ssDNA文库选自：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40nt-TGGACACGGT GGCTTAGT-3’或

5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-40nt-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTA-3’；

FITC标记的正向引物选自：

5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACG CAGCA-3’或

5’-FITC-GCAATGGTACGGTACTTCC-3’；

Biotin标记的反向引物选自：

3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’或

5’-biotin-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤1-2)中靶向细胞选自大鼠间充质干细胞；进一步优选进行如下处理：将健康成年大鼠脱颈处死，无菌条件下取股骨及胫骨，显露骨髓腔；用含10％FBS的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔冲出骨髓，然后反复吹打制成骨髓单细胞悬液，直接接种于培养瓶中，置37度培养箱培养；更进一步优选48小时后更换培养液，以后每3天换液1次；

所述方法中步骤1-2)中所述非靶细胞选自大鼠肝细胞系BRL-3A；优选进行如下处理：采用无酶的细胞消化液处理生长良好的细胞，按照5×10⁶接种于培养皿中，过夜培养，当细胞长至95％时即可用于文库筛选。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤1-3)中的扩增条件为：94度预变性3min，94度变性30s，55-56度退火30s，72度延伸30s，最后72度延伸5min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤1-4)中碱选自氢氧化钠；所述碱的浓度范围为50mM-200mM；进一步优选包括：dsDNA经浓缩管浓缩后，与链亲合素-磁珠在37度孵育40min-1h，加入50mM-200mM NaOH溶液进行碱变性5-7分钟，取上清液即得。

10.利用权利要求5-9任一所述方法获得的核酸适配子，特征在于，所述适配子具有SEQ ID NO.1或SEQNO.2所示的核苷酸序列。