[发明专利]无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用。

背景技术

胚胎干细胞（ESC）来源于哺乳动物囊胚的内细胞团，具有无限的自我更新能力，这种细胞是多能干细胞，能够分化成为三胚层中任何一种细胞类型。因为ESC的这些特性，使得ESC成为当今生命科学研究的热点。目前，ESC在治疗糖尿病、心肌疾病、神经退化性疾病、骨关节疾病等方面取得了突破性的进展。虽然ESC细胞的相关研究成果在临床医学领域展现出了广阔的应用前景，但无论是胚胎干细胞还是成体干细胞，其基础研究都与临床应用相距甚远，仍然存在很多难以解决的问题，例如：胚胎干细胞培养过程工序繁琐，存在动物组分且成本较高等，是目前所要解决的重大问题。

纳米技术和干细胞的相互结合很有可能会带来重大的突破。目前纳米技术在干细胞研究中的应用主要包括：（1）基于磁纳米技术的干细胞分离纯化,（2）纳米颗粒用于干细胞的标记和示踪，（3）纳米材料作为生物分子的载体调控干细胞增殖与分化，（4）纳米生物传感器监测干细胞生理功能，（5）纳米科技应用于干细胞治疗，（6）三维纳米结构用于干细胞的增殖与分化。尤其是纳米材料的结构和组成对干细胞自我更新、增殖和分化产生的影响，使纳米科技与干细胞的结合成为再生医学和材料科学之间出现的一项新领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用。

本发明提出的无机纳米材料层状双氢氧化物在小鼠胚胎干细胞培养中的应用，具体步骤如下：

(1)利用水热法，制备纳米层状双氢氧化物（SLW-1）的制备；

(2)通过差速贴壁法将正常培养的小鼠胚胎干细胞去除饲养层MEF细胞，按照2×104个/孔接种在铺有1%明胶的六孔板上，采用完全培养基培养24小时后，去除LIF因子，并在培养液中加入不同浓度的步骤(1)得到的SLW-1悬浮液培养4天；所述完全培养基的原料组成为：高糖DMEM；15％胎牛血清；0.1mmol／L非必需氨基酸；2mmol／L谷氨酰胺；0．1mmol／Lβ-巯基乙醇；1000U／ml白血病抑制因子；

(3)通过碱性磷酸酶染色、检测多能性基因以及内胚层、中胚层和外胚层三个胚层的标志分子的表达量，显示SLW-1能够促进mESC的自我更新力，抑制其分化；经SLW-1处理后的mESC能够形成拟胚体，并向三个胚层进行分化，说明该细胞仍具有多潜能性。

本发明中，所述SLW-1的粒径为20-200nm。

本发明中，所述SLW-1的有效浓度为20μg/ml-100μg/ml。

本发明的有益效果在于：层状双氢氧化物（SLW-1）作为一种新型的可控制的纳米材料近年来在各个领域都受到了广泛的关注，它具有良好的生物相容性，低细胞毒性以及具有较高的 zeta电位，这使得其更易于接触细胞表面。本发明在LIF因子去除的情况下运用SLW-1在一定程度上维持细胞自我更新，成本低廉，材料合成便捷，作用效果佳。

附图说明

图1为SLW-1透射电镜图。

图2为不同浓度SLW-1处理5天后的mESC碱性磷酸酶染色。其中：A为加入LIF，B为去除LIF，C为SLW-1加入后终浓度达到37.5μg/ml，D为 SLW-1加入后终浓度达到75μg/ml，E SLW-1加入后终浓度达到375μg/ml，F为 SLW-1加入后终浓度达到75μg/ml。

图3为Realtime PCR检测小鼠胚胎干细胞多潜能性和自我更新转录因子的表达。

图4为免疫细胞化学染色检测多潜能基因的表达。其中：A为 DAPI荧光染色标记细胞核，B为 Nanog荧光染色标记因子，C为DAPI荧光染色标记细胞核，D为 Oct4 荧光染色标记因子， E 为DAPI荧光染色标记细胞核， F为 Sox2荧光染色标记因子。

图5为免疫细胞化学染色检测分化后的拟胚体三个胚层的标志。其中：A为 内胚层荧光染色标记细胞核，B为内胚层特异性荧光标记，C为中胚层荧光染色标记细胞核，D为中胚层特异性荧光标记，E为外胚层荧光染色标记细胞核，F为外胚层特异性荧光标记。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。

实施例1：纳米层状双氢氧化物（SLW-1）的制备