[发明专利]一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法，具体涉及一株伪狂犬病毒PRV-HB制备的用于犬科动物伪狂犬防控的灭活疫苗，属于生物技术领域。 

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、脑脊髓炎等。犬和猪的伪狂犬病已屡见报道。该病最早在1813年流行于美国的牛群中，1902年匈牙利学者奥叶兹基(Aujeszky)第一次较为详细的描述了该病，故命名为奥叶兹基病(又称Aujeszky氏病，Aujeszky’s disease,AD)，1910年，Schmiedhofer通过过滤试验证实本病病原为病毒首先分离出病毒。 

1947年刘永纯发现猫的伪狂犬病以来，我国已有20多个省市先后报道该病。1995年，首次有貉感染PRV的报道。自2012年以来，山东，河南，河北等相继出现犬、狐和貉大规模感染PRV并死亡的报道。 

随着我国经济动物及毛皮动物养殖规模的逐年扩大，切实做好PR防控已迫在眉睫。由于PR造成的死亡率几乎高达100％，对养殖业危害巨大。疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效疫苗具有重要的意义。目前，在规模化猪场，一般采用PRV基因缺失疫苗进行防制PR。但是没有针对犬、狐和貉的PR疫苗，鉴于此本发明开展相关疫苗研究。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法，所述的伪狂犬灭活疫苗为伪狂犬病毒PRV-HB株保藏号为CGMCC NO.8758，分类命名为伪狂犬病毒，保藏日期为2014年01月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所。 

本发明目的之二是提供一种伪狂犬(PR)灭活疫苗的制备方法。 

伪狂犬病毒株的分离与鉴定：2012年，病料采集自河北省某经济动物养殖场发病死亡狐和貉脑、扁桃体及肝脏组织，病料经过研磨后，接种已长成单层的猪肾上皮细胞(PK15细胞)，对组织培养物用伪狂犬病(PRV)特异性引物进行PCR扩增鉴定gE和gB基因，扩增gE基因引物分别为gE–F和gE–R，其核苷酸序列分别SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；扩增gB基因引物分别为gB–F和gB–R，其核苷酸序列分别SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。并进行兔体致病性试验，证明分离的病毒为PRV，命名PRV-HB-12株，简称为PRV-HB株。 

由犬科动物(犬、狐、貉等)伪狂犬灭活疫苗病毒PRV-HB株制备的伪狂犬灭活疫苗。所述伪狂犬灭活疫苗中含伪狂犬病毒PRV-HB株≥10⁶TCID50/头份 

本发明伪狂犬病灭活疫苗的制备方法： 

伪狂犬病毒PRV-HB株增殖后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，加入灭活剂，及佐剂后制备疫苗。 

进一步的，上述制备方法中，所述的伪狂犬病毒PRV-HB株的增殖包括以下步骤： 

在已长成单层的PK15细胞中，按2％比例接种伪狂犬病毒种毒，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养96h，反复冻融3次后收获，置-20℃保存，应不超过6个月。 

更进一步的，在上述制备方法中，所述的灭活剂为β-丙内酯，所述的佐剂为Montanide PET GEL A(简称GEL A)。 

本发明伪狂犬病灭活疫苗的制备，具体包括以下步骤： 

将检验合格的伪狂犬病毒PRV-HB株，在PK15细胞中大量增殖，经0.2％β-丙内酯灭活48h,加入8％GEL A，利用桨式搅拌器，在剪切速度200rpm下，乳化10min，制备常规灭活疫苗。 

本发明PR灭活疫苗的安全性和免疫原性试验结果表明，本发明对犬具有良好的安全性，免疫犬后可并产生理想的免疫保护效果，可作为防控犬科动物伪狂犬的候选疫苗株。 

附图说明

图1为PRV-HB株gE和gB基因扩增结果图，其中，M为DL2000DNA Marker，1为阴性对照，2为gB基因片段扩增产物，3为阴性对照，4为gE基因片段扩增产物； 

图2为疫苗免疫后，各组犬抗体水平图。 

具体实施方式