[发明专利]一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，尤其涉及一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法。

背景技术

研究指出解偶联蛋白-1（UCP1）的一级结构由306个氨基酸残基构成，具有6个由α-螺旋构成的疏水环的过渡区域。UCP1分子的末端位于线粒体内膜的外表面，并且具有一个核苷酸结合位点。后来，有人深入地研究了UCP1分子上核苷酸结合位点的结构状况，结果表明，UCP1的核苷酸结合位点可能位于由UCP1分子构成的一个亲水通道上。通过核磁共振（NMR）和圆二色性分析，发现残基263～268位置正好具有一个α-螺旋结构，它是第六跨膜域的N-末端。若在结构或区域定向上发生改变，则会导致核苷酸或脂肪酸调节以及转运活性功能改变。有研究报道BAT线粒体UCP1的261～269区域在控制质子转移活动中具有重要作用，若残基Phe257-Lys268-Gly269缺失则导致蛋白质的核苷酸调节功能丧失，而且如果这个片断完全缺失，则会导致膜穿孔。用单链构象多态性检测（SSCP）和序列分析检测UCP1基因中的突变，结果表明有四个预期的氨基酸突变被检测到，即Arg40Trp（外显子l），Lys257Arg（外显子5），它们的发生频率较低，而Ala64Thr（外显子2）与Met229Leu（外显子5）突变发生频率则较高。采用2-叠氮ATP分解结果则显示出ATP的结合位点位于UCP1分子C-末端的第三个氨基酸残基上；核苷酸（GDP）结合位点位于第258和279号氨基酸残基。这四个突变在瘦人中的出现频率普遍比肥胖人低，因而这些UCP1基因突变可能与肥胖发生有关。另外，冷刺激能使褐色脂肪细胞膜上的肾上腺素受体被神经突触释放的儿茶酚胺类物质激活,造成脂肪动员,激活UCP1。UCP1引起线粒体氧化呼吸的电子传递和ATP产生解偶联作用,从而降低脂肪酸氧化代谢的产能效率,大量能量以热能的形式散发，经过BAT丰富的血管被输送到身体的各个部分。

国内现有的蛋白纯化技术多为使用蛋白纯化试剂盒，该方法方便快捷，但对试剂要求较高，且成本高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法，旨在解决解偶联蛋白-1分离纯化过程比较繁琐，每次纯化的量较小的问题。

本发明是这样实现的，一种褐色脂肪组织中解偶联蛋白-1分离纯化的方法，包括以下步骤：

（1）采集试验动物的褐色脂肪组织，将所述褐色脂肪组织与提取液A按质量体积比为1g：5ml混合研磨，在1500g、4℃条件下离心10min，去掉上层脂肪，取一次上清液；将所述一次上清液在500g、4℃条件下离心5min去掉沉淀，取二次上清液；

（2）将所述二次上清液在10000g、4℃条件下离心10min，取一次沉淀，将所述一次沉淀与提取液B按质量体积比为1g：5ml混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4℃条件下离心30min，取二次沉淀；

（3）将所述二次沉淀与提取液B按质量体积比为1g：2.5ml混匀，加入与步骤（2）所述提取液B等体积的体积浓度为5%的TritonX-100混匀，20kHz条件下超声处理，将超声后的溶液在10000g、4℃条件下离心30min离心，取三次上清液；

（4）将所述三次上清液装柱、洗脱纯化，得到解偶联蛋白-1；

在上述步骤中，所述提取液A的pH7.4，包括10mmol/LTrisbase、250mmol/L蔗糖以及2mmol/LEDTA；所述提取液B的pH6.7，包括20mmol/LMOPS、20mmol/LNa₂SO₄以及2mmol/LEDTA。

优选地，在步骤（2）以及（3）中，所述20kHz条件下超声处理为在20kHz条件下超声两次，每次25s。

优选地，在步骤（1）中，所述采集试验动物的褐色脂肪组织包括以下步骤：

A、将中缅树鼩断颈处死，用75%的酒精棉球擦拭肩胛间及颈部两侧的毛发，用解剖剪和镊子迅速剪下肩胛间及颈部两侧的褐色脂肪组织，去除上面的白色脂肪组织；

B、将所述褐色脂肪组织用提取液A按质量体积比为1g：3ml混匀清洗组织，去除组织上的毛发。

优选地，在步骤（4）中，所述将所述三次上清液装柱、洗脱纯化包括以下步骤：

A、取0.1～0.3g羟磷灰石溶于双蒸水中，装层析柱，保持柱面平整，静置30～40min；

B、取1～1.5ml所述三次上清液上样，用提取液B进行洗脱；