[发明专利]一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法

权利要求书

1.一种提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于包括以下步骤：

在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂；

所述的蛭弧菌为蛭弧菌（Bdellovibrio sp.）BDSM08，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M209171；

所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于包括以下步骤：在蛭弧菌微生物制剂中加入不同种类和/或不同浓度的保护剂，再以无菌DNB培养基填充。

3.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂为终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～15%蔗糖+终浓度1%～15%谷氨酸钠、终浓度1%～18%内消旋肌醇、终浓度1%～15%棉子糖、终浓度1%～20%葡萄糖或终体积百分比1%～25%甘油。

4.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的蛭弧菌微生物制剂通过以下步骤获得：

①DNB培养基的制备：称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白水解物，0.1g/L的酵母提取物，30g/L的海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调整PH至7.5，115℃高温蒸汽灭菌20min；

②宿主菌悬浮液的制备：在LB液体培养基中接种嗜水气单胞菌，培养，离心，弃上清收集菌体，每100mL培养液收集的菌体用2～3mL DNB培养基悬浮，得到宿主菌悬浮液，4℃保存备用；

③蛭弧菌的活化：取保藏的蛭弧菌，将蛭弧菌保藏液加入到DNB培养基中，再按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到活化后的蛭弧菌；

④蛭弧菌微生物制剂的制备：将活化后的蛭弧菌用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的生长情况；挑取有规则的单个噬菌斑，接种到DNB培养基中，同时按照50mL DNB培养基中接种500μL由步骤②制备的宿主菌悬浮液的比例接种宿主菌悬浮液，培养，得到蛭弧菌种子液，将蛭弧菌种子液进行离心，取上清液，得到蛭弧菌微生物制剂；

⑤用双层琼脂平板法检测蛭弧菌的浓度及生长情况，得到浓度为2.1×10¹¹～5.74×10¹²pfu/mL的蛭弧菌微生物制剂，用该蛭弧菌微生物制剂进行后续的加速试验。

5.根据权利要求4所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：

步骤②中所述的培养的条件为250rpm、30℃培养24h；

步骤②中所述的离心的条件为4℃、6000rpm离心15min；

步骤③中所述的蛭弧菌保藏液与DNB培养基的体积比为1:（25～50）；

步骤③中所述的培养的条件为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；

步骤④中所述的培养的条件为28～35℃、100～150rpm恒温培养48～72h；

步骤④中所述的将蛭弧菌种子液进行离心的条件为4℃、6000rpm离心20min。

6.根据权利要求1所述的提高蛭弧菌微生物制剂保质期的方法，其特征在于：所述的保护剂的筛选方法，包括如下步骤：

（1）将蛭弧菌微生物制剂、不同种类和/或不同浓度的保护剂混合，再以无菌DNB培养基填充，得到混合液；

（2）将混合液置于25℃、37℃、45℃、55℃、65℃下进行加速试验；

（3）定期取样，检测混合液中蛭弧菌的浓度；

（4）运用阿伦尼乌斯方程及步骤（3）记录的数据计算出蛭弧菌微生物制剂的保质期；通过比对保质期来确定保护剂的效果；当保质期越长，保护剂效果越好；保质期越短，保护剂效果越差；

步骤（1）中所述的保护剂为谷氨酸钠、蔗糖、内消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的至少一种。