[发明专利]一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因、植物表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因，其特征在于，通过对GenBank中危害番木瓜的两种病毒PRSV和PLDMV的多条基因组全长基因组序列进行比对，筛选两种病毒基因组范围内的共同保守区域，分别针对PRSV和PLDMV的复制酶Nib和辅助成分蛋白基因Hc-Pro，按照PRSV-Nib1-PRSV-Nib2-PLDMV-Nib1-PLDMV-Nib2-PRSV-Hc-Pro-PLDMV-Hc-Pro的排列顺序，连接成总长为621 bp的基因序列，如SEQ ID NO.1所示。

2.一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表达载体，其特征在于，由权利要求1所述包含PRSV、PLDMV的NIb和Hc-Pro保守区域的人工合成嵌合基因及载体质粒pSW4i构成。

3.权利要求2所述同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）首先以嵌合基因为模板，用高保真Taq酶进行PCR反应获得两个长度不同的长片段和短片段；为使用酶切鉴定的方法判断短片段的插入方向，在短片段的正向引物中插入NcoI位点；在长片段的正反向引物中分别添加酶切位点EcoRI和KpnI，使长片段定向插入pMD18-T载体上的EcoRI和KpnI 之间；

2）短片段和长片段与克隆载体连接，分别命名为pMD18-S和pMD19-L；分别用EcoRI 和KpnI对pMD19-L和pMD18-S进行双酶切后，回收pMD19-L的小片段和pMD18-S的大片段；两个片段连接转化形成含有目的发夹结构的克隆载体，命名为pMD18-LS；用EcoRI和SalI 对pMD18-LS进行双酶切，回收含有发夹结构的小片段并与经同样双酶切的克隆载体pRTL-SalI的大片段连接，构建成中间载体pRTL-LS；pRTL-LS经PstI单酶切回收含发夹结构的目的片段，与载体质粒pSW4i经PstI酶切后的回收产物连接，经电泳检测并测序验证RNAi植物表达载体pSW-LS构建成功。