[发明专利]一种倭蜂猴粪便DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA提取方法，具体地说，涉及一种倭蜂猴粪便DNA提取方法。

背景技术

现有技术中，本技术领域最接近的参考文献：张宝卫，魏辅文，李明等.大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法[J].动物学报，2004，50(3)：452—458.文献方法如下：

(1)通过重复离心,从保存的粪便样品中转移200-300mg入2ml灭菌的离心管中。

(2)加入1ml乙醇,振荡15s混匀,10000r/min离心3min,倾去上清;重复此步骤至上清

无异色。

(3)加入1ml双蒸水,振荡混匀,10000r/min离心3min,倾去上清;重复此步骤1次。

(4)加入500ul1.0%SDS,振荡混匀,置于55℃水浴10min,其间每3-4min取出混匀一次。

(5)取出离心管,10000r/min离心5min后,吸取上清液450ul至一新的2ml离心管中。

(6)加入30ul0.5molEDTA,20mg/ml的蛋白酶K20ul,振荡混匀,55℃水浴消化0.5-1h。

(7)取出离心管,加入等体积的酚25：氯仿24：异戊醇1，抽提10min。

(8)10000r/min离心10min,取出离心管。

(9)吸取450ul上清液至一新的2ml离心管中,加入45ul3mol的醋酸钠,1ml乙醇,混匀后-20℃放置20min。

(10)12000r/min离心10min沉淀DNA,倾去上清,室温中晾干。

(11)加入100ul双蒸水,冰上静置,溶解管底部的DNA。

(12)使用PCR产物纯化试剂盒E.Z.N.A.Cycle-pureKit(USA,Omega公司)纯化溶解的模板,纯化产物用50ul超纯水洗脱。电泳检测后,-20℃保存。

文献方法缺陷：提取DNA分子量小，降解程度高，PCR成功率低。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，该方法提取DNA分子量大，成功率高。其技术方案如下：

一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，包括以下步骤：

①称取0.05g-0.10g在-20℃下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀1min，4℃10000r/min离心3min，倾去上清液，重复3-5次至上清无异色；

②加入1ml无菌双蒸水混匀，4℃10000r/min离心3min，倾去上清液，重复3-5次至上清无异色；

③加入500ul1％SDS，振荡混匀，55℃水浴10min，其间每3-4min取出混匀；

④取出离心管，4℃10000r/min离心5min；

⑤将上清液转移到另一个新的2ml离心管中，加入30ul0.5mol/LEDTA，20mg/ml的蛋白酶K10ul，振荡混匀，55℃水浴消化30min-1h；

⑥取出离心管加入等体积的酚25：氯仿24：异戊醇1，于10000r/min条件下抽提10min，取上清液；重复抽提2-3次；

⑦吸取约450ul上清液至一新的2ml离心管中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，1ml无水乙醇，-20℃放置20min，4℃12000r/min离心10min以沉淀DNA，倾去上清，加入500ul70%酒精洗涤DNA，12000r/min离心2min，室温下自然晾干，加入适量无菌双蒸水，-20℃保存。

本发明的有益效果：本发明提取DNA分子量大，降解较少，PCR的成功率高。

附图说明

图1是依照现有技术文献方法提取粪便DNA的电泳图；

图2是本发明方法提取粪便DNA的电泳图；

图3是两种方法提取粪便DNA分子量图；

图4是两种方法提取粪便DNA进行PCR成功率的图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

一种倭蜂猴粪便DNA提取方法，包括以下步骤：

①称取0.05g在-20℃下冷冻保存的粪便，放入灭菌的2ml离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡混匀1min，4℃10000r/min离心3min，倾去上清液，重复3次至上清无异色；