[发明专利]一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物体外诊断技术领域，集中体现的是第三代遗传标记SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）和荧光检测技术的联合应用，能够利用相对微量的DNA模板快速确定样本的mtDNA单倍型类群，适用于线粒体DNA母系鉴定。

背景技术

目前法医学上用于个体识别的试剂盒都是检测常染色体STR遗传标记，由于它们之间不存在连锁关系且不同遗传标记的等位基因间不存在关联，所以个人识别时常染色体的总匹配概率是各遗传标记的匹配概率的乘积，因此进行个体识别时不需要无限地增加遗传标记，一定数量的遗传标记就可以满足法医学检测的要求。而应用于法医学实践的线粒体遗传标记呈单倍型遗传，整个线粒体基因组相当于一个遗传标记，因此线粒体DNA遗传标记的个人识别能力不能通过乘积来计算，要提高线粒体的个人识别能力，唯一的办法就是在mtDNA中发现并应用更多的多态遗传标记以覆盖更多的单倍群类型。

目前，用于mtDNA SNP检测方法主要有SnaPshot检测法、探针杂交显色法、直接测序法等，SnaPshot检测技术指的是基于剑桥标准序列，每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200－500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP，设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。先富集得到目的片段，经酶消化去除多余的dNTP，引物和其他单链DNA产物后再进行单碱基延伸反应，反应产物再次经过酶处理后进行毛细管电泳检测得到位点的SNP信息。这种方法引物设计简单，合成容易价格便宜。但这种方法也有明显的局限性：部分纯化用的消化酶价格昂贵；操作步骤繁琐，工作量大；引物结合区存在未知突变的位点检测成功率低，具体表现在线粒体控制区位点检测成功率低。

目前法医学上对线粒体SNP的研究主要采用直接测序法，主要检测mtDNA控制区（HV I和HV II区），这段序列处于mtDNA复制控制区长度约1122bp，由于其不编码蛋白质，因此在进化过程中选择压力小，决定其相比其他区域有更高的多态性。显然对这段高变区序列测序可以获得大量的信息，但由于该区域本身为突变热点区，存在遗传不稳定性，所以特异性尚显不够。研究发现增加编码区的特定多态性位点，能有效扩大线粒体单倍群的检测范围，能显著提高线粒体的同一母系鉴定能力。全序列测序理论上是最好的方法，但进行mtDNA全序列测序，工作量大，技术要求较高，难于推广，不适合在现有法医实验室中展开大规模的应用。

线粒体DNA研究的专利几乎集中在对线粒体疾病的探讨上，而在母系鉴定方面很少涉及，仅有的一篇《一种检测线粒体基因单倍型类群的方法及应用》采用的是寡核苷酸探针的方法，实时定量检测方法具有灵敏度高，特异性好，但同时存在通量低，引物探针设计复杂等缺点，不适合进行大样本检测。

发明内容

线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒的出现，为高效快速检测单核苷酸突变提供了途径。通过建立mtDNA高变区和编码区联合检测的模式，可以建立一种快速、高效、可靠的mtDNA单倍型分型策略和检测方法。和现有的STR试剂盒操作方法相同，符合当前法医实验室人员技术水平，且适合大样本检测，具有很大的应用前景。

本发明的目的是提供一种线粒体SNP荧光标记复合扩增试剂盒，采用四色荧光标记技术，特异性荧光引物扩增结合毛细管电泳检测，以FAM、HEX、TAMRA、SIZ荧光信号为检测信号。通过遗传测序仪对荧光信号的收集来检测特定的mtDNA突变，因此本发明在之前申请的35个SNP位点（专利公开号：CN103290108A）的基础上增加至61个位点，可以有效覆盖更多的单倍群类型。

技术方案是：