[发明专利]一种幼乌贼的标记方法、试剂和应用

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物领域，尤其是水生动物标记方法，具体为幼乌贼染色标记方法、试剂和应用。

背景技术

标志放流是研究水生生物分布规律、估算自然种群数量和评估人工增殖放流效果的重要手段之一。国内外常见的标志方法有挂牌标志、切鳍、荧光标记、金属线码标记、分离式卫星标志和生物标志等内外部标志法，实践表明，应用普遍且更容易回收的反而是最为传统的挂牌标志法。因此，有必要开展新型标志方法的探索，特别是有特点的游泳生物品种，以建立高效的标志方法，可为更加准确地评价增殖放流的效果提供技术保障。

乌贼同一般贝类的区别在于，一般贝类贝壳都是长在躯体的外部形成外骨骼，而乌贼的贝壳却在长期进化中演变成了内贝壳，形成了内骨骼。乌贼的内骨骼位于体背侧皮肤下的壳囊内，很发达，呈长椭圆形前端圆，末端有一尖形突起。内骨骼为石灰质，背侧硬，腹侧疏松，空隙多。内骨骼不但可以增加身体的坚强性，又可使身体比重减小，有利于游泳，并有助于保持平衡。

专利200610070448.6公开了一种标志金乌贼的方法，将孵化后的金乌贼置于含有60～80ppm染色剂的海水中，浸泡染色20～28小时，所用染料为茜素络合物指示剂。金乌贼是一种有针类乌贼，其内壳上带有骨针，该方法将通过有染色剂浸泡，使金乌贼内壳骨针部出现肉眼可见的半椭圆形浅紫色圆圈；在荧光显微镜下观察，为亮红色。但这种方法并不适用于无针类的乌贼。

所使用的茜素络合物指示剂为3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸（3-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-1,2-dihyox-yanthraquinone，又称Alizarin Complexone，ALC），微溶于水、乙醇和乙醚，碱性条件下溶解于水，可用于比色法检测离子。分子式为C19H15NO8，结构如式（I）。

ALC的水溶液在pH值小于6时呈黄色，在6与10之间呈红色，大于11时呈蓝紫色。

发明内容

本发明的目的在于将茜素络合物3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸用于标记幼乌贼，提供一种幼乌贼内壳染色的标记方法。

技术方案为，将茜素络合物3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸用于标记幼乌贼；茜素络合物3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸可用于制备标记幼乌贼的试剂。

所述的试剂为注射剂，是3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸水溶液，pH值为6～10，更优选7～9；其中3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸的浓度为250～500ppm，优选为300～400ppm。

标记幼乌贼的方法为，将上述注射剂从以下两个位置中的至少一个注射入幼乌贼的内骨骼，每一个位置的注射量为0.6～0.8ml：

（1）幼乌贼内骨骼的末端，

（2）幼乌贼内骨骼侧边的中心位置。

从内骨骼的末端注射时，针头沿着与内骨骼平行的方向，旋转刺入0.8～1.2cm，然后向外拔出0.2～0.5cm，再将注射剂推注入内骨骼；从内骨骼侧边的中心位置注射时，针头沿着与内骨骼平行的方向，旋转刺入0.5～0.8cm，然后向外拔出0.2～0.3cm，再将注射剂推注入内骨骼。针头直径为0.3～0.35mm。

上述幼乌贼的胴长为20～50mm，；优选的，胴长为20～40mm。优选的，幼乌贼为曼氏无针乌贼。

本发明利用3-氨基甲基茜素-N,N-乙酸染色液在幼乌贼内壳钙化层的沉积作用，解决了幼乌贼的染色操作问题。染色标记的效果好、操作方便、标志材料浪费少；幼乌贼死亡率低。并且标志色能够长久保持，肉眼可识别。该染色标志法和试剂兼具体外标志和体内标志的双重效果。由于乌贼表皮薄而透明，在标志放流后，无需解剖或借助其它仪器设备能在自然海区快速分辨并回捕经染色的标志个体。

附图说明

图1为实施例1中，注射幼乌贼的位置。图（a）和图（b）分别为从幼乌贼末端和侧端的中心位置注射标记的示意图。

具体实施方式

实施例1

所使用的ALC试剂购自日本株式会社同仁化学研究所。

（1）染色母液的配制：

将100mg茜素络合指示剂ALC粉末与少量蒸馏水混合，用浓度为0.1mol/L的NaOH溶液作为pH调节剂，定容至50ml，制成浓度为2.0g/L的染色母液备用，染色母液的pH值为8；

（2）标记注射针剂的制备：将上述母液用蒸馏水稀释为350mg/L的注射液，注射液的pH值为7～8。

操作方法：