[发明专利]一种可过量表达膜蛋白细菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物表面活性剂领域，特别涉及一种可过量表达膜蛋白细菌及其应用。

背景技术

本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。

正常生理条件下膜蛋白的天然表达水平较低，对其异源大量表达成为功能和结构研究的先决条件。结合膜蛋白纯化和结晶的困难，膜蛋白的异源表达也因其疏水特性、细胞脱容量的有限性、对宿主细胞的毒性等问题成为膜蛋白相关研究的瓶颈。尤其对于真核细胞膜蛋白的原核表达，宿主的不相容性往往会带来更大的难题：截至2005年止，尚无一例以重组表达方式获得结构信息的膜蛋白的报道。而一个耐受膜蛋白的表达菌对于成功表达膜至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可过量表达膜蛋白细菌，该菌株对膜蛋白异常有极大耐受性，采用上述菌株，可过量表达膜蛋白，具有良好的应用前景。

本发明的一种可过量表达膜蛋白细菌，该菌株为埃希氏大肠杆菌，命名为Escherichia coli1098-3，保藏号为CGMCC No.8696，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。于2014年1月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的一种可过量表达膜蛋白细菌的应用，具体方法如下：利用超表达载体携带外源膜蛋白基因序列，通过电击转化或热激转化转入菌株，菌株37℃培养OD₆₀₀至0.3-0.4，加IPTG至终浓度0.7mg/L，培养6-18h，收获菌种。

所述电击转化的工艺条件为：0.2cm的电转化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200欧；电击后取出加入1ml SOB液体培养基，37℃培养1小时；涂布于SD平板。

所述热激转化的工艺条件为：100L感受态细胞置于冰上，将细胞均匀悬浮；加入10L连接好的质粒，DNA浓度为10pg/L，混匀；冰上放置30分钟；42℃水浴热激55秒；冰上放置10分钟；加100L LB培养液，37℃250转/分振荡培养30分钟；与此同时将LB平板置于37℃，放置片刻后加入4uL IPTG和40uL X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附渗透；将细菌涂布在含抗生素琼脂平板上，平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

本发明描述一种从油污污染土壤中分离得到的细菌，膜厚度大，可耐受较大机械压力，同时也能够耐受膜蛋白毒性，可以对膜蛋白外源表达有较好耐性。根据BLAST聚类分析及形态学鉴定结果（见图1），将该菌株定命名为Escherichia coli1098-3。该菌经检测可显著降低表面张力，国内外已经发现菌株是前所未见或未有应用的。

本发明提供的菌株Escherichia coli1098-3的特征如下：

本发明该菌菌落圆形，凸起，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明；呼吸类型为好氧呼吸，在有氧条件下生长良好，革兰氏染色呈阳性，形态观察菌体杆状。测定菌株的16S rRNA部分序列，进行系统发育学分析。

有益效果

本发明对膜蛋白异常有极大耐受性，采用上述菌株，可过量表达膜蛋白，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明菌株16S rRNA序列系统发育树；

图2左图为普通菌种过量表达膜蛋白细胞结构，右图为本发明菌株过量表达膜蛋白细胞结构。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

菌种来源：本菌种来源于油污污染土壤，具体分离方法如下：