[发明专利]用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法

说明书

技术领域

本专利涉及一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法。属于兽用生物制品领域。 

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种猪的烈性传染性疾病，感染后的临床症状受不同因素的影响而变化多样，从急性死亡到隐性感染均可能出现，是危害我国养猪业的一种重要动物疫病，目前主要以点状散发流行为主，流行范围极广，全国各个养猪地区几乎均有发生。我国对于猪瘟的防控措施主要以猪瘟活疫苗大规模免疫为主，这是猪瘟大规模爆发得以控制的主要原因。 

我国猪瘟兔化弱毒株制备的猪瘟活疫苗是国际上公认的最安全、有效的猪瘟疫苗之一，应用十分广泛，在对猪瘟的防控中起到了重要的作用，其具有对不同日龄猪均安全、诱导免疫反应快和可以保护猪只抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击等优点。猪瘟兔化弱毒疫苗在理论上能够产生极佳的免疫效果，但是为了能够在临床使用时发挥疫苗的最大作用，就必须实现对商品化疫苗质量的有效控制。疫苗质量控制的一个重要方面就是要保证所生产疫苗具有符合标准的活病毒效价，能够确实激活被免疫动物的免疫系统。疫苗效力的定义为疫苗接种动物获得保护自身抵抗感染的能力，或在接种疫苗动物体内诱导产生的抗体转移到后代使新生动物获得保护的能力。对于弱毒疫苗而言，对宿主的免疫效力是通过病毒感染宿主细胞激活免疫系统而实现的，在一定范围内，感染宿主的疫苗毒越多，对宿主免疫系统的激活就越强。因此，猪瘟兔化弱毒疫苗的效价是可以通过确定疫苗中有感染性病毒的数量（浓度）来衡量的。 

在我国猪瘟兔化弱毒疫苗效价的判定目前采用的是以兔体定型热法和猪免疫攻毒为基础的动物试验的方法，其中以兔体定型热法的应用最为广泛。但是该方法存在很多弊端，如:检测结果易受兔体个体差异和环境因素影响、费时费力并且成本较高等。建立不依赖动物试验的效检替代方法是大势所趋，也势在必行。对于活疫苗而言，疫苗的效价（滴度）取决于疫苗中含有的有感染性微生物数量（浓度）。产生满意效果的最小滴度是建立在测定最小有效剂量研究的基础上。 

发明内容

本发明的目的在于建立一种不使用实验动物的、重复性高的、能够有效反映猪瘟疫苗中有感染性病毒粒子数量（浓度）的效检替代方法 

本发明实施的技术方案 

1.一种用检测病毒细胞感染量评价细胞系源猪瘟活疫苗免疫效力的方法，其特征在于：该方法是将传代猪瘟疫苗稀释后接种适宜的细胞系，疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒通过细胞增殖后用于病毒细胞感染量的测定，该方法检测到的活的具有感染性的猪瘟病毒兔化弱毒病毒，其检测结果与疫苗免疫原性直接相关； 

2.该效检方法是用猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒株病毒感染细胞后的上清液或细胞裂解液用于病毒感染量的测定； 

3.该检验方法是用猪瘟抗原捕捉ELISA检测感染细胞中猪瘟病毒兔化弱毒株病毒抗原，评价疫苗中病毒的细胞感染量，该方法特异性强，重复性好； 

4.该检验方法的检测样品是用细胞系包括猪睾丸细胞、猪肾细胞等扩繁的猪瘟兔化弱毒株病毒，此类细胞适合猪瘟病毒增殖。 

本发明的具体描述 

一、效检方法的建立 

（一）检验样品的制备 

按常规方法消化生长良好的猪睾丸细胞系（ST细胞），按适当细胞密度接种若干细胞培养瓶（板）。置于37℃，5%CO₂温箱中培养48h至细胞长至良好单层。将猪瘟活疫苗用细胞维持液做10倍系列稀释至10^-7。将10^-4～10^-7稀释度的猪瘟兔化弱毒分别接种已培养48h长至80%～100%单层的正常ST细胞。每个稀释度分别接种4瓶ST细胞，每瓶细胞接种4mL稀释后的病毒液，留4瓶正常ST细胞以细胞维持液代替病毒液做相同的接毒处理作为空白对照，置于37℃、5%CO₂温箱中孵育4h后，吸弃病毒液，用维持液润洗三次后（每次以4mL维持液润洗）更换为6mL新鲜维持液，置于37℃、5%CO₂温箱中培养。4d后第一次收毒换液，每个稀释度取一瓶细胞收获一半的细胞培养液上清，剩余上清液连同细胞直接置于-20℃冻结，反复冻融三次收获病毒液，其余每瓶细胞弃去旧维持液更换新鲜维持液6mL，置于37℃、5%CO₂温箱中继续培养。此后每隔4d按上述方法收毒换液一次，最后一次收获时，取一半的细胞培养液上清收获，另一半上清液连同细胞置于-20℃冻结保存，冻融三次收获病毒液。共收获4次。所有收获的样品全部置于-20℃保存待用。