[发明专利]一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用

说明书

技术领域

一种黄酒用双功能酶的纯化及交联酶聚集体的制备与应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。

背景技术

随着我国人民生活水平的提高，酒类饮料等发酵食品的消费量日趋上升。在发酵生产酒精饮料的过程中，有许多不需要的副产品，尿素就是其中之一，尿素在酸性条件下、高温灭菌、蒸馏过程或长时间储存过程中，容易和乙醇形成氨基甲酸乙酯。

氨基甲酸乙酯（EC），是2A类致癌性的物质，微量存在于大部分发酵食品和酒精饮料中。国外许多国家（加拿大、美国、日本、欧盟等）和组织已经对发酵食品和酒精饮料中氨基甲酸乙酯作了限量要求，因此我国对各种不同产品中氨基甲酸乙酯的含量进行检测势在必行。

我国黄酒中90%以上的氨基甲酸乙酯是来源于酒中所含尿素与乙醇的反应：。因此利用脲酶将饮料酒中的尿素及时除去，对于控制酒中氨基甲酸乙酯的生成具有重要意义。采用酒用酸性脲酶处理煎酒前的黄酒，可除去黄酒中大部分尿素，减少生成EC的可能性，而EC降解酶则能直接有效的分解成品黄酒中已经产生的EC。已有研究报道肠杆菌Enterobacter sp. R-SYB082能产生一种酸性脲酶同功酶，可实现同时去除黄酒中底物尿素及产物EC。

交联酶聚集体由荷兰Delft大学Sheldon小组提出。采用物理方法沉淀酶蛋白，得到酶聚集体，再用交联剂交联，制备交联酶聚集体。其活性和稳定性可与交联酶晶体技术相媲美，制备过程不需要复杂耗时的结晶、纯化步骤，是一种低成本、易操作、高活性和稳定性的新型酶固定化方法。具有对酶纯度要求低、无需载体、单位体积活性高、空间效率高等优点。本发明采用（Providencia sp.） JNB815中提取的游离酶制成交联酶聚集体，能够同时降解黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯，对黄酒中EC的控制具有双重效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄酒用双功能酶的纯化工艺及交联酶聚集体的制备与应用方法。

本发明的技术方案，一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法，将从（Providencia sp.）JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离酶，经乙醇分级沉淀、DEAE-FF离子交换层析、Superdex 200凝胶层析进行纯化和SDS-PAGE凝胶电泳验证，初步证明为同一种具有两种酶活性的双功能酶。游离酶经乙醇沉淀和京尼平交联，制成交联酶聚集体。

1.其工艺为：

（1）游离脲酶提取：

菌种普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326。

种子培养：种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH调pH 7.0，用纯水配制；接种量3%，37℃摇床培养8-12 h，转速150 rpm；

发酵培养：发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH2PO4 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，HCl调pH5.5，用纯水配制；接种量5%，37℃摇床培养20-24 h，转速150 rpm；

以上菌种经种子培养、发酵培养后，所得发酵液在4℃、8000rpm离心5 min后，弃去上清液，所得菌体用去离子水洗涤两次，再用pH4.5、50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，8000r/min离心5min后获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎；超声波破碎条件为300W、15min，破碎时间3s、间隔时间3s，处理量35mL；破碎液在4℃、10000rpm离心20min，收集上清液，即得到游离脲酶粗酶液；

（2）游离脲酶的纯化：

a、乙醇分级沉淀：将步骤（1）中由（Providencia sp.）JNB815所提取的游离脲酶粗酶液，依次采用质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分级沉淀，10000r/min离心20min，所得沉淀复溶于pH6.8、25mmol·L^-1磷酸钠缓冲液中，测定上清液的酶活并绘制醇沉曲线；