[发明专利]猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法及其引物

权利要求书

1.一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物，其特征在于，包括如Seq ID No.1所示的上游引物序列PEDV-P1、如Seq ID No.2所示的下游引物序列PEDV-P2及如Seq ID No.3所示的探针PEDV-MGB。

2.一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，通过PCR扩增、克隆获得阳性重组质粒，然后以已知浓度的目的基因作为模板进行荧光定量PCR反应，作出标准曲线图以及标准曲线，用于测算出待测样品中的病毒含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增、克隆是指：采用根据权利要求1所述上、下游引物进行PCR扩增目的片段，鉴定为阳性的PCR产物，克隆到pMD18-T载体并转化到DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的标准曲线是指质粒浓度与Ct值的比例曲线，该标准曲线通过以下步骤获得：由质粒提取试剂盒提取重组质粒，用紫外分光光度计测定OD260nm值，并将质粒浓度换算成拷贝数/μL，对模板进行定量RT-PCR反应，并在每一循环的延伸温度结束时采集荧光信号进行实时检测。

5.根据权利要求2或4所述的方法，其特征是，所述的标准曲线为：Y=-3.358LogX+37.49，其中：Y表示Ct值，X表示病毒数量，单位为拷贝数/mL。

6.根据权利要求2或4所述的方法，其特征是，所述的模板是指：已知病毒拷贝数的标准DNA模板，经10倍系列稀释，且同一稀释梯度做重复孔对照。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，每个模板浓度做3个重复，取平均值计算变异系数。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的荧光定量PCR反应体系总体积为25μL，包括：10×EX Taq Buffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.5μL、250μM的上、下游引物各1μL、5U/μL的Ex Taq0.2μL、10pmol/μL的探针0.5μL、质粒模板1μL、DEPC水16.3μL。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的荧光定量PCR反应条件如下：94℃预变性2min，再以40个循环进行PCR扩增，每循环以94℃变性20s，50℃延伸20s，最后72℃延伸10min。