[发明专利]敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶基因的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

长期以来，一直被认为脂肪细胞的主要功能是储存能量。但随着对脂肪细胞的深入研究，脂肪细胞其它方面的功能也逐渐显露出来。研究表明脂肪细胞在免疫反应、高血压、肥胖、胰岛素抵抗等代谢疾病中都起着重要的作用。

最初，脂肪细胞被分为两类：白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。但随着啮齿动物腹股沟脂肪部位的beige(brown-in-white,brite)细胞的发现，褐色脂肪细胞又可以被细分为两类：经典的褐色脂肪细胞与brite/beige脂肪细胞

白色脂肪细胞内含有一个巨大的圆形脂滴，细胞核呈扁平状且位于细胞边缘。脂滴几乎占据了细胞的99%的空间。白色脂肪细胞主要是通过甘油三酯和胆固醇的形式，将能量储存于脂滴当中。但是白色脂肪细胞不仅可以储存能量，它还可以分泌脂肪细胞因子如：脂联素、瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子α等等。这些脂肪细胞因子在能量代谢调节、免疫反应等多种生理现象中发挥着重要作用。

褐色脂肪细胞的外形呈多边形，细胞核为圆形，且细胞内的脂滴呈多室分布于整个细胞中。褐色脂肪细胞含有大量的细胞质基质，并且细胞内的线粒体含量很高。因为线粒体内的细胞色素含有铁原子，所以含有大量线粒体的褐色脂肪细胞的颜色为褐色。褐色脂肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是：线粒体内膜上的解偶联蛋白1(UCP1)的表达量很高。所以，褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCP1来产热从而消耗能量而不产生ATP：即褐色脂肪细胞可以通过UCP1，将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联，进而通过氧化磷酸化解偶联呼吸，将脂肪酸β氧化产生的能量以热量的形式散失掉。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能，可以维持体温恒定，也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量，从而降低肥胖发生的概率。

两种褐色脂肪细胞的分布是不同的，经典的褐色脂肪细胞主要分布于啮齿动物的肩胛骨区域，而Beige脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的皮下脂肪组织中。对于人类来说，褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内，但是目前研究发现，成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞，且它们与啮齿动物的beige脂肪细胞相似。除了分布差异外，两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源；但是beige脂肪细胞存于白色脂肪组织中。研究发现，在一定条件下，冷冻，特定基因的敲除或者视黄酸（retinoid acid，RA），成纤维细胞生长因子21（FGF21）等药物的刺激，beige脂肪细胞可以由白色脂肪细胞转分化而来。因此，beige脂肪细胞的研究受到了广泛关注。筛选可以使白色脂肪细胞褐色化(即转分化为beige脂肪细胞)的药物对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。

筛选白色脂肪细胞褐色化的药物，主要需要检测UCP1的表达的变化，尤其是蛋白水平的变化。但是目前无论利用实时定量RT-PCR或者western blot的方法进行药物筛选，都费时费事费力费钱。实时定量PCR至少需要一天的时间来检测UCP1的变化，而western blot至少需要两天的时间来进行检测分析。

因此，构建一个可以快捷、准确地筛选白色脂肪细胞转分化成beige脂肪细胞的药物的平台显得尤为重要。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型及其构建方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型在筛选白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述非人哺乳动物为小鼠。

本发明还提供了一种敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型的构建方法，包括以下步骤：

1)、将非人哺乳动物的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后的终止密码子去掉；

2)、利用序列号为SEQ ID NO:1的串联肽2A在步骤1)的去掉了终止密码子的解偶联蛋白1基因的最后一个外显子后连入荧光素酶基因；

3)、利用C57和129杂合背景的小鼠ES细胞打靶，通过同源重组构建敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。

本发明还提供了采用上述构建方法构建得到的敲入有解偶联蛋白1-荧光素酶的非人哺乳动物模型。