[发明专利]三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及牛奶中三聚氰胺污染的检测技术，具体涉及一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和用途。

背景技术

三聚氰胺简称三胺，化学名1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨，分子式为C₃N₆H₆，相对分子质量为126.12，是一种低毒无味的纯白色单斜棱晶体，广泛应用于涂料、建材、造纸、皮革、纺织等行业中。由于三聚氰胺的含氮量高达66%，是蛋白质平均含氮量的4倍，而常用的凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量时却不能区分这种非蛋白氮，因此被不法商贩利用添加在饲料和食品中以提高食品和饲料中粗蛋白质检测数值。动物实验表明，三聚氰胺对于哺乳动物属于微毒、低毒类化学物质，长期饲喂可能造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部出现结石，并可进一步诱发膀胱癌。联合国负责食品安全标准的机构国际食品法典委员会2010年7月6日表示，该委员会已就食品中三聚氰胺的允许含量设立了新标准。新标准规定，每千克婴儿配方奶粉中的三聚氰胺含量不能超过1mg，而每千克其他食品或动物饲料中的三聚氰胺含量不能超过2.5mg。因此，加强对三聚氰胺检测技术的研究和快速检测技术的发展是非常有必要的。

目前，检测三聚氰胺比较经典的方法有高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。另外，目前常用的还有酶联免疫法（ELISA）。但由于以上方法均需先进检测仪器，检测费用昂贵、步骤繁琐耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。胶体金免疫层析法具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，是目前国内外检测三聚氰胺的主要监控方法，但仍存在一些缺陷，如稳定性较差、灵敏度较低、无法实现定量检测、基质效应明显背景干扰大，且颜色单一，难以实现多检和联检。

荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。但是相比胶体金等传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此相比上述检测方法，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便的优点。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、携带方便且制备成本低、可快速检测三聚氰胺污染的三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条。

本发明的另一个目的是提供上述三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条在检测牛奶中三聚氰胺污染的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案实现的：

一种三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条，由样品结合垫、层析膜、吸水垫、粘性底衬组成，粘性底衬上依次粘贴样品结合垫、层析膜和吸水垫；所述层析膜上依次包被有三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体，以三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物所在区域为测试线，以羊抗鼠抗抗体所在区域为质控线；所述样品结合垫包埋有荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，所述荧光微球是内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液，荧光微球由聚苯乙烯包被，粒径100～300nm，固体含量1%～10%，官能团密度100～600uEq/g。

三聚氰胺荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：

1）制备三聚氰胺单克隆抗体；

2）制备荧光微球标记的抗三聚氰胺单克隆抗体，并将其包埋在样品结合垫上；

3）将样品结合垫、层析膜、吸水垫由一端依次粘贴在粘性底衬上，切割、组装试纸条，用于检测三聚氰胺。

具体地说，步骤包括：

1）将三聚氰酸二酰胺与邻苯二甲酸酐反应，制备三聚氰胺半抗原；

2）将三聚氰胺半抗原与载体蛋白偶联，制备三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物；

3）用三聚氰胺半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；