[发明专利]一种小鼠RANKL突变体及其表达载体的构建、表达及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物学、分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种具有生物活性的不同半胱氨酸位点（Cys）突变的小鼠核因子κB受体活化因子配基（RANKL）的突变体及其载体的构建、表达及应用。

背景技术

骨骼具有为了自身的形态变化和维持血钙浓度而重复形成和吸收、进行重建的特征。正常的骨骼通过由成骨细胞、骨细胞介导的骨形成及由破骨细胞介导的骨吸收而处于动态平衡状态。骨骼动态平衡的维持是一个多因素、多环节的复杂调控过程，而成骨细胞、骨细胞与破骨细胞间的信号耦联是核心。这种信号耦联是由一系列的分泌性蛋白在起着关键的调控作用，而其中最为重要的便是到目前为止研究最为透彻的核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κBligand，RANKL)。

在骨骼系统中，RANKL主要由成骨细胞、骨细胞表达和分泌，它通过与破骨细胞表面的RANK蛋白（即RANKL的受体）相互作用进而调节破骨细胞的分化成熟。同时，成骨细胞还会分泌骨保护素蛋白(OPG)，它通过与RANK蛋白竞争结合RANKL，从而起到抑制破骨细胞分化成熟的作用。一系列研究已经充分表明，RANKL/RANK/OPG信号体系在成骨细胞-破骨细胞耦联及骨骼代谢平衡中具有核心作用。但是，相较于已被充分阐释的RANKL-RANK相互作用后导致破骨细胞分化成熟的信号机制，RANKL蛋白在成骨细胞内的定位情况及其影响机制目前尚不清楚。

RANKL蛋白在体内存在两种形式：全长RANKL及可溶性RANKL（soluble RANKL，sRANKL）。其中，小鼠RANKL蛋白全长316个氨基酸，人RANKL蛋白全长317个氨基酸，两者同源性达84%。而sRANKL则是分泌至细胞外的RANKL，它由一系列的蛋白酶如TACE、ADAM10和MMP-14等对全长RANKL进行剪切得到，剪切位点在小鼠RANKL的139Phe，在人RANKL的140Ile。RANKL蛋白具有典型的TNF结构域，与TNFalpha、CD40ligand、Apo2L（TRAIL）及Fas ligand（FasL）等同属TNF家族。此外，全长RANKL还包括茎状结构区、一段短片段的疏水性跨膜区和位于RANKL氨基端1-48的低复杂性氨基酸序列。TNF结构域是RANKL-RANK及RANKL-OPG的相互作用区，是调控破骨细胞分化成熟的关键部位；225Glu、222Arg、299Asp氨基酸对于RANKL-RANK的相互作用是关键的。研究发现，RANKL-OPG的相互作用对于RANKL在细胞（Hela细胞、原代成骨细胞和骨细胞）内的定位至关重要，OPG使RANKL定位于细胞溶酶体中，而CRD结构域（RANKL-OPG相互作用的关键区域）缺失的OPG蛋白则不具有这种作用。但是否有其它因素影响RANKL在成骨细胞内的定位及分泌还有待于进一步的研究。

发明内容

为此，本发明所要解决的问题在于提供一种小鼠RANKL突变体以及表达该突变体的表达载体和表达系统，进而便于更准确、方便、高效的研究不同Cys位点突变对小鼠RANKL蛋白表达及定位的影响。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种小鼠RANKL突变体，其氨基酸序列如SEQ.ID NO：1、SEQ.ID NO：2、SEQ.ID NO：3、SEQ.ID NO：4、SEQ.ID NO：5、SEQ.ID NO：6、SEQ.ID NO：7、SEQ.ID NO：8、SEQ.ID NO：9、SEQ.ID NO：10、SEQ.ID NO：11、SEQ.ID NO：12、SEQ.ID NO：13、SEQ.ID NO：14或SEQ.ID NO：15中任一所示。

本发明还提供了一种编码上述小鼠RANKL突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ.ID NO：16、SEQ.ID NO：17、SEQ.ID NO：18、SEQ.ID NO：19、SEQ.ID NO：20、SEQ.ID NO：21、SEQ.ID NO：22、SEQ.ID NO：23、SEQ.ID NO：24、SEQ.ID NO：25、SEQ.ID NO：26、SEQ.ID NO：27、SEQ.ID NO：28、SEQ.ID NO：29或SEQ.ID NO：30中任一所示。

本发明提供了一种含有编码上述小鼠RANKL突变体的基因的表达载体。