[发明专利]转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因作物生态风险评价技术领域,具体涉及一种转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有30多亿人口以稻米为食。同时水稻又是虫害最多的粮食作物之一，每年由于稻纵卷叶螟、钻蛀性螟虫等鳞翅目昆虫的为害，造成重大的产量损失（Cheng，1996；Nathan，2006）。在生产实际中，鳞翅目害虫的防治长期依赖于化学农药，化学农药的滥用不但增加了水稻的生产成本，而且污染环境，还容易使害虫产生抗性，降低农药的药效（Su et al，2003）。因此，高抗鳞翅目的抗性品种是一种经济、有效、环保的防治手段。然而，在水稻及野生稻中，难以找到高抗鳞翅目昆虫的抗源。要培育高抗鳞翅目害虫的水稻品种，需借助于外源抗虫基因。Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白被用作生物源杀虫剂已经有五十多年的历史，对鳞翅目害虫有稳定的防治效果。目前，转Bt基因抗虫水稻是控制鳞翅目害虫的主要抗虫水稻。

然而，抗虫转基因植物的利用给人类带来利益的同时，也存在一定潜在的生态风险。转基因抗虫植物的生态安全性评价集中在：对靶标害虫的抗性治理、对非靶标生物和生物多样性的影响、基因漂移问题和对土壤微生物的影响等。转基因抗虫植物对非靶标生物的潜在影响是有关转基因作物环境风险评价的重要部分。目前，国际上的风险评价工作者以及转基因植物相关管理部门广泛采用“分层次评价体系”开展转基因植物对非靶标生物影响方面的研究工作（Romeis et al.，2008；王圆圆等，2011）。该评价体系就是选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验到半田间试验，再到田间试验分层次分阶段进行的系统评价。

褐飞虱Nilaparvata lugens是温带和热带水稻田间最主要的害虫之一，是转Bt基因水稻种植过程中重要的非靶标植食性昆虫。草间钻头蛛是稻田系统中十分常见的广谱性捕食者，是稻田蜘蛛的优势种之一。它能十分有效的控制飞虱和叶蝉，是褐飞虱最主要的捕食者，其通过捕食过程能够摄取到Bt杀虫蛋白，有存在生态风险的可能性，那么，建立一套系统评价转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛是否安全的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种安全有效、操作简便、成本低廉的转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法。

本发明目的的实现方式为，转基因抗虫水稻对捕食性天敌草间钻头蛛安全性评价方法，包括如下4个部分：

(1)三级营养试验：通过水稻—褐飞虱—草间钻头蛛的食物链评价转Bt基因抗虫水稻通过猎物介导对草间钻头蛛的安全性影响；

草间钻头蛛二龄幼蛛于指型管中单头饲养，管口塞以棉花，管底放一吸水海棉，分别以不同水稻材料稻苗饲养的褐飞虱若虫作为食物饲喂草间钻头蛛，发育前期用低龄若虫，发育后期用高龄若虫，每日提供充足的食物与水源，并观察蜘蛛的蜕皮与存活情况，直至死亡或发育为成蛛；待蜘蛛发育成熟，用万分之一电子天平称重，然后雌雄配对，记录其产卵前期及第一个卵袋的含卵量；每个水稻材料处理供试蜘蛛150头；

选择草间钻头蛛的幼蛛发育历期、产卵前期、成蛛体重以及第一个卵袋含卵量作为评价参数指标，并进行统计分析，评价由褐飞虱若虫介导的转Bt基因抗虫水稻对草间钻头蛛的安全性影响；

(2)蛋白传递规律：通过ELISA检测手段鉴定草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的途径和程度；

于玻璃罐中分别放入15日龄不同水稻品种、系的稻苗，接入对应水稻材料饲养的褐飞虱若虫及草间钻头蛛雌成蛛，取食5天后，分别对水稻叶鞘，褐飞虱若虫，草间钻头蛛进行取样，叶鞘30±1mg，褐飞虱若虫30±1mg，草间钻头蛛10头；每个处理重复4～5次；

采用ELISA技术，分别对以上样品中Bt蛋白的含量进行检测，确定通过食物链草间钻头蛛暴露于Bt蛋白的程度；

(3)捕食功能反应：通过比较转Bt基因抗虫水稻与非转基因亲本对照品种稻田采集的草间钻头蛛捕食功能参数，评判转Bt基因抗虫水稻对该非靶标生物的影响；

于种植不同水稻材料的稻田分别采集25头大小相似的健康草间钻头蛛雌成蛛，试验之前只给草间钻头蛛雌成蛛提供水，不提供猎物，使其饥饿24小时；在玻璃管底部放置含水海棉，移入4根15日龄稻苗，按照5、10、20、30、40头/管的密度接入已在不同水稻材料上饲养的1～2龄褐飞虱若虫，再放入1头草间钻头蛛雌成蛛，每个密度处理重复5次，24小时后考察各玻璃管中的褐飞虱被捕食的情况；