[发明专利]H9N2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒株，尤其涉及一株分离的H9N2亚型禽流感病毒（Avain Influenza Virus）J/ZY毒株及用该毒株制备的预防H9N2亚型禽流感病毒的灭活疫苗，属于禽流感病毒毒株的分离和应用领域。

背景技术

禽流行性感冒(简称禽流感，Avain Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类(包括家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A类传染病。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。

H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。虽然该H9N2亚型禽流感病毒(A1V)对禽群呈低致病力，主要临床表现仅为轻度呼吸道症状，但由于易与其他致病微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起了禽群的高发病率和致死率，对各国养禽业的危害也很大。更重要的是，该亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流传，给人类健康带来了严重的威胁。

预防禽流感发生与传播的最有效手段是疫苗接种。目前，市售的禽流感疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差异大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株；

本发明的目的之二是将所分离的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株应用于预防H9N2亚型禽流感。

本发明的目的之三是提供一种制备预防H9N2亚型禽流感病毒的灭活疫苗的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明从中国吉林省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中分离得到一株低致病性的H9N2亚型禽流感病毒J/ZY毒株，本发明将分离的毒株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8853；分类命名为：禽流感病毒。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年3月7日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从中国吉林省某养鸡地区的疑似H9N2禽流感发病鸡群中，无菌采取具有典型临床症状病鸡的肺脏和肝脏等组织剪碎，按1:5（W/V）比例加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后，-40℃/室温冻融3次，3000r/min离心15min，取上清液。将上述病料上清液通过0.22μm微孔滤器除菌，尿囊腔接种10日龄非免疫鸡胚。每份病料接种8枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2mL，同时作不接种对照，37℃孵育。弃去24h内死胚，无菌收集48h的鸡胚尿囊液，-40℃保存备用病毒分离后需要在SPF鸡胚上进行3次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒。如此经三次纯化后，以10^-3稀释度接种9-11日龄SPF胚，48h后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。本发明将分离的H9N2亚型禽流感病毒毒株采用RT-PCR鉴定，扩增得到753bp的目的基因片段，与预期结果相符。对分离的病毒所做分型鉴定结果为所分离的毒株为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/Jilin/J/ZY（缩写为J/ZY）。

本发明通过鸡胚半数感染量(EID50)、半数组织感染量(TCID50)和静脉接种指数(IVPI)试验检测分离的病毒J/ZY株的致病性，试验中对细胞毒和胚毒进行了同步试验，以比较不同培养方式繁殖的病毒液在毒力方面的差异。测定结果显示，细胞毒、胚毒EID50/0.1ml分别为10^6.9、10^6.3；细胞毒、胚毒TCID50/0.1ml分别为10^6.5、10^6.1；细胞毒、胚毒IVPI分别为0.8、0.9；细胞毒、胚毒HA分别为2¹⁰、2⁹。以上结果显示本发明所分离的病毒J/ZY株为低致病性禽流感病毒。