[发明专利]一种登革病毒四价CTL表位DNA疫苗的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域；更具体地，本发明涉及登革病毒四价CTL表位DNA疫苗的构建和应用。

背景技术

登革病毒(DV)是一种引起登革热(DF)以及致死性登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的黄病毒属蚊媒病毒。DV的四种高度相似的血清型(D1V、D2V、D3V、D4V)均可通过埃及伊蚊和白纹伊蚊的叮咬传播给人类。DV已流行于热带和亚热带的100多个国家和地区，每年约有5000万-1亿的DF病例和25万-50万的DHF/DSS病例。自1978年中国广东重现DV以来，广东、海南、台湾、云南、广西等地区每隔几年就会出现DV的流行和爆发，而且福建、浙江、上海、贵州等地区也时有输入性登革病例报道。迄今为止DV的四个血清型均在中国流行过。近年来，由于全球气候变暖、人口快速增长及频繁流动、病毒株变异等因素的影响，DV流行的国家和地区不断增加，其不但对全球人类健康构成了极大的威胁，而且给公共卫生事业造成了极大的经济负担。虽然多年来的研究已经广泛地了解了DV感染的特征，但在研制特异性的有效抗DV的药物方面并没有取得突破性的进展，因此研制具有较好免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗具有重要的现实意义和社会效应。

DV感染或接种登革传统疫苗(灭活疫苗或减毒活疫苗)诱导机体产生的非中和抗体具有介导抗体依赖性增强效应的作用(ADE作用，在机体二次感染不同DV血清型时可加重病情)，而DV感染机体诱导的细胞毒性T细胞(CTL，活化的CD8+T细胞)可以杀伤DV感染的细胞，对机体具有保护效应。由于，CTL表位是抗原中诱导特异性CTL反应的最基本的结构和功能单位，不含有可诱导副作用(如ADE作用)的成分。因此，基于CTL表位的CTL表位DNA疫苗(采用基因工程的方法将编码多个CTL表位的基因连接并插入表达质粒)是一种很有希望的兼具免疫预防和免疫治疗作用的新型疫苗。此种DNA疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达并被加工释放出单个CTL表位，后者即可诱导CTL表位特异性CTL反应。与传统疫苗相比，CTL表位DNA疫苗具有成本低、便于贮藏和运输、安全性高、在体内维持时间长、制备简单、无潜在副作用(如ADE作用)等优点。

HLA-A的主要等位基因HLA-A*0201在不同种族人群中的覆盖率可达40％以上。因而选择DV四个血清型中多个受HLA-A*0201限制的CTL表位，将其基因片段串联起来插入真核表达载体，构建成DV四价(四个血清型)CTL表位DNA疫苗，这样不但覆盖了大部分人群，而且又覆盖了四个血清型。HLA-A*0201转基因小鼠表达人HLA-A*0201分子，是研究HLA-A*0201限制性CTL反应及评价多表位DNA疫苗免疫原性的重要动物模型。

由于目前尚缺乏防治DV感染的特效方法，因此迫切需要研发出可用于防治DV感染的新型疫苗，尤其是基于CTL表位的能覆盖DV四个血清型的四价CTL表位DNA疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用DV四个血清型的CTL表位构建登革病毒四价CTL表位DNA疫苗的方法，及其在机体免疫以及疫苗制备中的应用。

本发明将编码15个DV的HLA-A*0201限制性CTL表位的核苷酸以串联方式构建成一种具有简易制备，稳定表达、高特异性和覆盖人群范围广的多表位DNA疫苗，以达到预防和治疗不同DV血清型感染的目的。

本发明涉及一种四价CTL表位DNA疫苗，其由一个真核表达质粒pcDNA3.1(-)载体中和一段如SEQ ID NO：1和图1所示的外源基因片段组成。考虑到宿主细胞表达外源蛋白时对密码子的偏爱性，还对密码子进行了优化，以期获得最佳免疫效果。